高效液相色谱法检测饲料中三唑类杀菌剂残留

赵春娟 ， 高文惠 *

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄，050018）

三唑杀菌剂是一种杀真菌剂，是指含有1，2，4-三唑环的化合物，因具有抗菌作用及调节植物生长作用，被广泛应用于水果、蔬菜、谷粮等病虫害的防治。随着三唑类农药的广泛应用，其在食品、饲料和环境中的残留问题也逐渐引起人们的重视。目前，三唑类杀菌剂残留的检测一般采用色谱法，如液相色谱法（张敏等，2012）、液质联用检测技术（Li等，2012）、气质联用检测技术（Silva等，2013），但同时检测饲料中4种或4种以上三唑类杀菌剂残留的研究还鲜见报道。本实验采用高效液相色谱法同时分离检测饲料样品中腈菌唑、戊唑醇、联苯三唑醇、烯唑醇4种三唑类杀菌剂残留，以期实现快速、高效的分离分析效果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 LC-20A高效液相色谱仪 （日本岛津公司）、KH5200型超声波清洗器 （昆山禾创超声仪器有限公司）、LD5-2A低速离心机 （北京雷勃尔离心机有限公司）、FA2204分析天平（上海菁海仪器有限公司）。

甲醇、乙腈均为色谱纯（天津市光复精细化工研究所），联苯三唑醇（纯度为99%，上海酶联生物科技有限公司），腈菌唑（纯度为97%，郑州绿康化工有限公司），烯唑醇、戊唑醇 （纯度均为98%，北京金宝在线科技有限公司）。

三唑类杀菌剂标准储备液的配制：分别准确称取腈菌唑、戊唑醇、联苯三唑醇、烯唑醇标准品10 mg，各用乙腈溶解并分别定容至50 mL，使用时再根据需要用乙腈稀释至相应浓度。

1.2 色谱条件 色谱柱：Promosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 检测波长 210 nm， 流动相为甲醇-水（85∶15，V/V），流速 1 mL/min，柱温为 30 ℃，进样量 20 μL。

1.3 样品前处理 称取2.5 g样品，用20 mL乙腈提取（提取两次，每次 10 mL），超声 15 min，于4000 r/min离心10 min，合并2次上清液，浓缩，定容至5 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，待上机测定。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择 对腈菌唑、戊唑醇、联苯三唑醇和烯唑醇分别进行紫外光谱扫描，以确定液相色谱的检测波长。由图1可知，腈菌唑、戊唑醇、联苯三唑醇和烯唑醇的最大吸收波长分别为196、199、214 nm 和 194 nm， 但 甲醇 在 190 ～208 nm有吸收。综合考虑以上情况，本实验选择210 nm为最佳检测波长。

图1 腈菌唑、戊唑醇、联苯三唑醇和烯唑醇的紫外光谱图

2.2 流动相和流速的选择 本实验分别采用甲醇、乙腈、甲醇-水作为流动相，考察洗脱能力。甲醇和乙腈的洗脱能力均很强，4种三唑类杀菌剂不能实现分离，从经济角度考虑，向甲醇中加入水，采用甲醇-水混合溶剂作为流动相，分别考察了甲醇-水体积比为 95∶5、90∶10 和 85∶15， 流速分别为0.5、0.8、1 mL/min时各三唑类杀菌剂的分离情况。当甲醇-水体积比为95∶5和90∶10时，戊唑醇和联苯三唑醇不能实现完全分离，后将甲醇-水体积比降到85∶15（V/V）时，戊唑醇和联苯三唑醇可实现基线分离。然后考察了流速对被测物保留行为的影响，当流速为0.5 mL/min和0.8 mL/min时，被测物出峰时间较长，且峰形较宽；当流速为1 mL/min时，出峰时间明显缩短，峰形好。故本实验选择流动相比例为 85∶15（V/V），流速为 1 mL/min。此条件下4种三唑类杀菌剂的色谱分离情况如图2所示，9 min内4种杀菌剂实现了基线分离。

图2 4种三唑类杀菌剂的分离色谱图

2.3 线性关系和检测限 移取标准储备液，配制成浓度为0.05～200 μg/mL的标准混合溶液，在1.2色谱条件下测定，以峰面积对浓度绘制标准曲线。4种三唑类杀菌剂的线性关系和检测限见表1。

表1 4种三唑类杀菌剂的线性关系及检测限

由表1可知，腈菌唑的线性范围为0.15～200 μg/mL，检测限为 0.05 μg/mL；戊唑醇、联苯三唑醇和烯唑醇的线性范围为0.3～200 μg/mL，检测限为0.1 μg/mL；4种目标物的线性相关系数≥0.9938。

2.4 样品测定 将鸡饲料和猪饲料样品按照1.3中方法处理，在确定的最佳色谱条件下进行样品测定。结果显示，在鸡饲料和猪饲料中均未检出4种三唑类杀菌剂。图3为典型样品鸡饲料的色谱分离图。

图3 鸡饲料的色谱分离图

2.5 加标回收率和精密度实验 对鸡饲料和猪饲料进行低水平和高水平的加标回收率实验，结果见表2。由表2可知，样品加标平均回收率（AR）为83.4%～101.2%，相对标准偏差（RSD）＜3.00%。 表明该法回收率和精密度较高，分析方法可行。

表2 饲料样品中4种杀菌剂回收率和精密度（n=5） %

3 结论

本实验建立了同时分离检测饲料中4种三唑类农药残留的高效液相色谱法。腈菌唑、戊唑醇、联苯三唑醇、烯唑醇在9 min内实现了基线分离，4种杀菌剂的线性相关系数≥0.9938，腈菌唑的检测限为0.05 μg/mL，戊唑醇、联苯三唑醇和烯唑醇的检测限为0.1 μg/mL，样品加标平均回收率为83.4%～101.2%，相对标准偏差＜3.00%。该方法可用于饲料样品中三唑类杀菌剂残留的检测。

[1]张敏，黄其亮，殷帅，等.基于离子液体的分散液相微萃取-高效液相色谱法测定水中三唑类农药[J].华中农业大学学报，2012，31（3）：341～345.

[2]Li Y B，Dong F S，Liu，et al.Simultaneous enantioselective determination of triazole fungicides in soil and water by chiral liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2012，1224：51～60.

[3]Silva E A S，Lopez-Avila V，Pawliszyn J.Fast and robust direct immersion solid phase microextraction coupled with gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method employing a matrix compatible fiber for determination of triazole fungicides in fruits[J].Journal of Chromatography A，2013，1313（25）：139～146.