DHA对猪血液单核细胞炎症的影响

苏 欣， 沈 立， 张 宇

（1.白城职业技术学院，吉林白城 137000；2．吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062）

二十二碳六烯酸（DHA，22：6n-3）是 Omega-3多不饱和脂肪酸（PUFAs）的一种，哺乳动物自身不能合成，因此，组织和循环系统中的DHA主要来源于饮食摄取。鱼类是提供DHA的主要食品来源，少量α-亚麻酸 （ALA）也可以转化为DHA（Dariush 和 Jason，2011）。 研究表明，DHA 能够影响多种疾病进程，包括糖尿病、动脉粥样硬化、哮喘、高血压、关节炎和非酒精性脂肪肝等（Hemant等，2011），有益于人类健康。

慢性炎症可导致多种疾病的发生，如心血管疾病、代谢疾病、癌症及病毒性疾病。大量研究表明，DHA可以预防炎症诱导型疾病的发生（Howard 和 Dennis，2002；Lisa 和 Zena，2002）。细胞水平试验也证明，DHA抑制促炎转录因子NFκB的活性，抑制促炎因子 IL-6、TNF-α和MCP-1的表达和分泌 （Kumar等，2012；Jia等，2006），从而影响免疫反应；DHA还可以通过抑制NLRP3炎症小体的激活而抑制炎症和代谢紊乱（Yan 和 Jiang，2013）。

猪与人类的基因组大小和组成非常相近，并且猪与人类的器官大小、循环系统和代谢系统极为相似（Lynsey等，2011）。因此，猪不仅可以作为人类的食品，还是研究某些疾病的理想模型。本研究采用荧光定量PCR和Elisa方法观察不同浓度DHA对猪血液单核细胞（PPBMCs）炎症的影响，为深入研究DHA对动物和人类健康的保护作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 淋巴细胞分层液Histopaque®-1077（Sigma-Aldrich）、LPS、（Sigma-Aldrich）、DHA（Sigma-Aldrich）、Elisa 试剂盒 （武汉博士德）、实时荧光定量试剂 （北京天根）、RPMI1640（Hyclone）、FBS（invitrogen）。

1.2 猪血液单核细胞分离 使用血液抗凝管收集（EDTA-2Na）猪外周血，每次收集 10 mL，按照Histopaque®-1077说明书，进行单核细胞分离，最后用RPMI1640培养液重悬单核细胞，放至培养皿中，37℃、5%CO2培养，备用。

1.3 细胞培养与处理 猪血液单核细胞于含10%FBS的 RPMI1640培养液，37℃、5%CO2培养，次日使用。每次均使用新鲜分离的细胞进行试验。对照组加入DMSO，DHA使用3个浓度（5、10、20 μmol/L），每个浓度为一个处理组，每个处理组3个重复，单独孵育细胞24 h，进行炎症因子检测。LPS使用常规浓度（1 μg/mL），处理 1 h后加入DHA进行共孵育，24 h后进行炎症因子检测。

1.4 CCK-8细胞活力检测 将细胞悬液计数，以104个细胞/孔的密度接种于96孔板中，12 h后加入不同浓度 DHA（5、10、20 μmol/L）进行孵育，每个处理组5个重复，12 h后加入CCK-8溶液，继续孵育4 h，最后使用酶标仪在450 nm处进行测定。

1.5 统计分析 试验数据均使用Prism 5软件进行统计分析，各处理组与对照组之间使用t检验分析，P＜0.05为具有显著性差异。

2 结果

2.1 DHA对PPBMCs活力的影响 由图1可见，使用5 μmol/L和10 μmol/L DHA分别处理PPBMCs 12 h和24 h，对细胞活力没有显著影响，但20 μmol/L处理24 h时，细胞活力显著下降。因此选择5 μmol/L和10 μmol/L DHA进行后续试验。

图1 CCK-8检测PPBMCs活力

2.2 DHA对PPBMCs炎症的影响 使用不同浓度 DHA（5 μmol/L 和 10 μmol/L）分别孵育 PPBMCs，在 12 h 和 24 h 分 别 检 测 IL-6、TNF-a 和MCP-1的mRNA水平和分泌浓度。结果显示，DHA呈浓度依赖性抑制PPBMCs中IL-6、TNF-a和 MCP-1的表达和分泌（图 2a、b）。

图2 DHA对炎症因子表达和分泌的影响

2.3 DHA对LPS诱导的PPBMCs炎症的影响用1 μg/mL LPS孵育1 h，然后用不同浓度DHA处理 24 h，检测 IL-6、TNF-a和 MCP-1的 mRNA水平和分泌浓度。结果显示，LPS上调PPBMCs炎症水平，而DHA能够抑制LPS诱导的炎症升高（图 3a、b）。

3 讨论

多不饱和脂肪酸是指碳链长度为18～22个碳原子并含有两个或两个以上双键的直链脂肪酸，根据双键的位置不同通常分为ω3和ω6。ω3-PUFAs主要包括DHA、二十碳五烯酸 （EPA）和ALA（Hemant等，2011）。 小鼠体内体外试验结果显示，DHA可以转化为脂蛋白类，存在于脂肪组织，还可作为细胞膜的磷脂成分，而在血液中DHA还能以非酯化的游离脂肪酸形式与白蛋白相结合。大量临床数据显示，DHA保护心血管健康和代谢平衡。DHA的长期摄入伴随着体内炎症和甘油三酯水平降低，因此，研究推测DHA的保护作用主要是通过影响体内炎症反应来实现，并且在人类细胞系和小鼠体内也证实了这一观点。

图3 检测DHA对LPS诱导的炎症因子表达和分泌的影响

本研究中，不同浓度DHA对原代猪血液单核细胞基础水平的炎症具有抑制作用，并且能够抑制LPS诱导的炎症反应。因此，本研究为深入研究DHA在猪体内的抗炎作用提供了理论依据。

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