黄连解毒汤对白色念珠菌的抗真菌作用研究

曹俊敏 曹毅 ⋆ 杨雪静 杨晓红 陶茂灿 赵竞宜

·实验研究·

黄连解毒汤对白色念珠菌的抗真菌作用研究

曹俊敏 曹毅 ⋆ 杨雪静 杨晓红 陶茂灿 赵竞宜

目的 观察黄连解毒汤对白色念珠菌的体外抗真菌效果。方法 采用微量稀释法药物敏感性试验测定黄连解毒汤对标准菌株、氟康唑敏感株、氟康唑中度敏感株、氟康唑耐药株4种白色念珠菌的最低抑菌浓度。结果 黄连解毒汤对4种白色念珠菌均具有较好的抑制作用，其对白色念珠菌标准菌株的最低抑菌浓度为4mg/ml，对氟康唑敏感型白色念珠菌最低抑菌浓度为8mg/ml，对中度敏感型白色念珠菌最低抑菌浓度为16mg/ml，对耐药型白色念珠菌最低抑菌浓度为 64mg/ml。结论 黄连解毒汤对白色念珠菌有明显的抑制作用，可作为临床用药的参考。

念珠菌感染是目前临床多见的一种真菌感染。随着艾滋病的传播，癌症放化疗的开展、器官移植后免疫抑制剂的应用，以及导管等生物材料使用的增多，白色念珠菌感染率持续上升。临床上通常推荐以唑类抗真菌药物为主的治疗方案。由于同类药物的长期广泛使用，导致念珠菌的耐药问题日益突出。本课题组选取黄连解毒汤，研究其对白色念珠菌的体外抗真菌作用，为临床用药方案提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）菌株：白色念珠菌SC5314（ATCC MYA-2876），购于中国科学院。白色念珠菌氟康唑敏感株Y01.09（ATCC 76615-09）、白色念珠菌氟康唑中度敏感株Y01.108（ATCC 76615-108）、白色念珠菌氟康唑耐药株 Y01.19（ATCC 76615-19），由南京中国医学科学院皮肤病研究所真菌保存室馈赠。（2）主要试剂：黄连解毒汤粉末（10:1）由浙江中医药大学药学院中药资源研究所提供。蛋白胨（peptone）、葡萄糖（glucose）、琼脂粉（Agar）、RPMI－1640培养基、二甲基亚砜（DMSO）、超纯水均订购于上海生工生物工程有限公司。（3）主要仪器：多功能全波长酶标仪购于Thermo Scientigic公司。IEC CL31R高速冷冻离心机（Multispeed）、 气浴恒温振荡器购于江苏金坛市金城国胜实验仪器厂。生化培养箱（HJX-250B-Z型）为上海博讯实业有限公司产品。手提式压力蒸汽灭菌锅购于上海华线医用核子仪器有限公司。电子天平（BSA223S）为赛多利斯科学仪器有限公司（Sartorius）产品。普通光学显微镜为上海光学仪器厂产品。96孔细胞培养板购于生工生物工程（上海）有限公司。（4）药物贮存液的配制：将黄连解毒汤粉末溶于DMSO，加纯水配置成终浓度256 mg/ml的药物贮存液，后分装于1.5ml无菌聚丙烯离心管中，取封口膜密封管口，保存于-80℃冰箱备用。实验时取出解冻即可。药物贮存液切勿反复冻融使用。在-60℃以下的温度条件下，多数抗真菌药物能保存至少6个月而不失去活性。

1.2 实验方法 （1）菌液的制备：取出保存于-80℃冰箱的白色念珠菌菌株，接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基，30℃培养24h，连续传代2次，挑取培养基上菌落直径＞1mm的单个菌落，接种于含100 ml沙氏 液体培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床，30℃，1500r/ min振荡培养26h。取培养后的菌液，用血细胞计数板计数并用液体沙氏 培养基调整菌液浓度为1×106CFU/ ml。（2）微量稀释法药敏实验：将配置好的黄连解毒汤贮存液加入96孔板中，起始药物浓度为256mg/ml，然后在96孔平板上用RPMI-1640培养液连续倍比稀释，使第2孔至第11孔的药物浓度依次为128mg/ml，64mg/ml，32mg/ml，16mg/ml，8mg/ml，4mg/ml，2mg/ ml，1mg/ml，0.5mg/ml和0.25mg/ml，每孔100μl药液。DMSO在每孔中含量均＜1%。第1孔和第12孔加不含药的RPMI-1640培养液，第1孔为空白对照不接种菌液，第12孔作为生长对照接种菌液。将配置完成的菌液用微量移液器加入制备好的药敏平板中，2至12孔每孔100μl；第1孔不加菌液，为空白对照空。将接种后的平板置于微量振荡器上振荡5min，使菌液与药液混合均匀，30℃培养箱中培养24h。（3）结果的判读 孵育24h后观察96孔板上受试菌株的生长状况，以无菌生长的测试孔中药物的浓度为此组的MIC值。每孔重复3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才可接受；当MIC值相差＞2个浓度时，则需重新实验，直到符合要求为止。

2 结果

2.1 黄连解毒汤对白色念珠菌SC5314的抑菌效果 经微量稀释法药敏实验测得，在浓度为4mg/ml的药物孔中无菌生长，即黄连解毒汤对白色念珠菌SC5314（ATCC MYA-2876）的最低抑菌浓度为4mg/ ml。见表1。

2.2 黄连解毒汤对氟康唑敏感型白色念珠菌的抑菌效果 经微量稀释法药敏实验测得，在浓度为8mg/ml的药物孔中无菌生长，即黄连解毒汤对敏感型白色念珠菌的最低抑菌浓度为8mg/ml。见表1。

2.3 黄连解毒汤对氟康唑中度敏感型白色念珠菌的抑菌效果 经微量稀释法药敏实验测得，在浓度为16mg/ml的药物孔中无菌生长，即黄连解毒汤对中度敏感型白色念珠菌的最低抑菌浓度为16mg/ml。见表1。2.4 黄连解毒汤对氟康唑耐药型白色念珠菌的抑菌效果 经微量稀释法药敏实验测得，在浓度为64mg/ml的药物孔中无菌生长，即黄连解毒汤对敏感型白色念珠菌的最低抑菌浓度为64mg/ml。见表1。

表1 黄连解毒汤对四种白色念珠菌的药物敏感性试验结果

3 讨论

白色念珠菌（Candida albicans）又称白假丝酵母菌，是一种真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，为条件致病性真菌。当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式（芽生菌丝相）侵入细胞引起疾病，严重的深部真菌感染可危及患者的生命［1，2］。

氟康唑是目前临床上治疗白色念珠菌感染的首选药物，被广泛作为预防性和治疗性药物使用，且该类药物的作用方式为抑菌作用，因此疗程长，在长期使用过程中逐渐使耐药真菌比例增多或出现耐药突变。日益严重的耐药现象和有限的治疗药物使白色念珠菌感染成为临床上迫切需要解决的问题［3］。目前对中药活性物质及复方的作用机制研究主要是参照西医药理学中抑菌机制的研究思路，在分离提取药物有效成分后研究中药活性物质及复方对体外真菌的直接抑制作用，从其有效成分的作用机制来解释中药的作用［4，5］。

黄连解毒汤，首载于葛洪《肘后备急方》，是祖国医药中已发现的具有良好抗菌作用的药剂之一，由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，具有清热、泻火、解毒功效，主治一切实热火毒、三焦热盛之证。现代研究认为黄连解毒汤除了对多种细菌如金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、乙型链球菌和变形杆菌均有抑制作用外，对白色念珠菌的抗菌作用亦较显著。单用黄连或黄连素，对细菌或真菌等较易产生抗药性，而用本方则可避免，且可以提高抑菌作用，有增强机体抵抗力，增加解毒能力，减轻单味药的毒性和副作用的优点［6］。

本实验采用微量稀释法药物敏感性实验研究了黄连解毒汤对白色念珠菌的抗菌活性，对白色念珠菌SC5314（ATCC MYA-2876）的最低抑菌浓度为4mg/ ml，对敏感型白色念珠菌最低抑菌浓度为8mg/ml，对中度敏感型白色念珠菌最低抑菌浓度为16mg/ml，对耐药型白色念珠菌最低抑菌浓度为 64mg/ml。实验证实黄连解毒汤对标准株、敏感株、中度敏感株、耐药株4种白色念珠菌均有较好的抗真菌作用。中药具有来源广、毒性小、价格低和少耐药等优点，因此黄连解毒汤对白色念珠菌的抑菌作用在临床上有良好的应用前景。

1 Arendrup MC. Epidemiology of invasive candidiasis. Curr Opin Crit Care, 2010,16(5): 445～452

2 Kothavade RJ,Oberai CM,Valand AG,Panthaki MH. Disseminated cryptococcosis and fluconazole resistant oral candidiasis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome(AIDS). J Infect Dev Ctries, 2010,4(10): 674～678.

3 曹毅,翁鹤,杨晓红,等. 高通量测序技术在黄连解毒汤抗白念珠菌机制研究中的应用及探讨. 环球中医药, 2013,6(1):55～59

4 陈降华,丁飞,李文平.中草药抗呼吸道病毒感染的研究进展.中兽医学杂志,2009(3):54～56.

5 陈虹.中草药对禽兽8种肠道病原菌的体外抑菌试验.兰州:甘肃农业大学动物医学院,2009.

6 黄悼伟.黄连解毒汤药理研究及临床应用进展.中医药信息,1993,12(6):37～39.

Objective To explore the anti-fungal Activity of Huanglian jiedu decoction（HLJDD）against Candida albicans in vitro. Methods Through microdilution assay，we investigate the effect of Huanglian jiedu decoction on Candida albicans and explore the MIC of four different kinds of Candida albicans including standard strain，sensitive strain，neutral strain，and drug resistant strain of Candida albicans. Results The standard strain of c. albicans grows fast within 24 to 32 hours and after 56 hours the viable counts of c. albicans decline. MIC of Huanglian jiedu decoction against sensitive strain and standard strain of Candida albicans was 8 mg/ml and 4 mg/ml，and that of neutral strain was 16 mg/ml，while that of drug resistant strain was 64 mg/ml. Conclusion Huanglian jiedu decoction could inhibit the growth of C.albicans in vitro.

Huanglian jiedu decoction Candida albicans Chinese herb antifungal

国家自然科学基金（81173271）

310006 浙江中医药大学附属第一医院

*通讯作者