大肠癌中Neuropilin-1的表达与血管生成的关系

蔡巧英 华汉巨

大肠癌中Neuropilin-1的表达与血管生成的关系

蔡巧英 华汉巨

目的 探讨大肠癌组织中神经纤毛蛋白-1（NRP-1）的表达与大肠癌生物学行为及血管生成的关系和意义。方法 应用免疫组化SP 法检测正常大肠黏膜、大肠癌组织中NRP-1、血管内皮生长因子（VEGF）、CD34的表达并测定微血管密度（MVD）。结果 大肠癌组织中NRP-1的表达及MVD高于正常大肠粘膜组织，且与大肠癌淋巴结转移、浸润程度密切相关。NRP-1表达阳性组的MVD高于阴性组。与VEGF表达呈正相关性。结论 NRP-1参与了大肠癌的发生、浸润与转移；NRP-1与大肠癌的血管生成有关；NRP-1作为肿瘤抗血管治疗的靶点具有一定的价值。

大肠癌 神经纤毛蛋白-1 血管生成 免疫组化

大肠癌是常见的消化道肿瘤之一，随着人们生活水平提高及饮食结构、生活方式的改变，我国大肠癌发病率呈上升趋势。 神经纤毛蛋白-1（NRP-1）为collapsin/semaphorin 家族受体，在神经细胞导向、轴突生长方面发挥调节作用。近年研究发现，NRP-1可作为血管内皮生长因子（VEGF）家族成员的受体，在肿瘤血管新生方面发挥重要作用。作者通过检测大肠癌组织中NRP-1、VEGF、CD34的表达并计数微血管密度（MVD），探讨大肠癌组织中NRP-1的表达与血管生成的关系和意义。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集本院外科2010年1月至2013年10月手术切除并经病理检查确诊的大肠癌组织及正常大肠组织标本各52例，其中男31例，女21例；年龄48～76岁，平均年龄68岁。所有患者术前均未接受化疗、放疗及免疫等治疗。肿瘤位于结肠13例、直肠39例。肿瘤分期按Dukes分期。鼠抗人NRP-1单克隆抗体购自英国Abcam公司，鼠抗人VEGF、CD34单克隆抗体及SP试剂盒均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法 （1）免疫组化：采用免疫组化SP 法，严格按照试剂盒说明书操作。以PBS液代替一抗作为阴性对照，公司提供阳性片作为阳性对照。（2）阳性结果判断标准：NRP-1、VEGF阳性染色信号为棕黄色或棕褐色颗粒，结果判定采用Volm双评分法［1］，高倍视野下观察每张切片染色均匀区阳性细胞着色强度及阳性细胞率，并分别进行分级记分，染色强度：0分：不染色；1分：轻度染色（淡黄色）；2分：中度染色（黄色）；3分：强染色（棕黄色或黄褐色）。阳性细胞率：1分：阳性细胞＜25%。2分：25%～50%。3分：＞50%。按上述两项之和判断结果：0分：阴性（-）。1～2分：弱阳性（+）。3～4分：阳性（++）。5～6分：强阳性（+++）。共计数 5 个视野，取平均值。（3）MVD计数：参照Krishnan等［2］的方法：CD34 阳性表现为血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色，以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为 1 个血管计数。低倍（×40）下观察，确定3个血管着色最密集的区域，然后在高倍（×400）下计数这3个视野的微血管数，取其平均值为该片的MVD值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0 软件处理。计数资料采用χ2检验、Fisher 精确概率法。MVD以（x±s）表示，两组间比较采用成组t检验，多组间采用单因素方差分析。等级相关采用非参数Spearman 等级相关分析。 以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠癌组织中NRP-1的表达情况及MVD比较 大肠癌组织中NRP-1主要表达于癌细胞胞膜上和胞质内，以胞质为主，呈棕黄色或棕褐色的颗状物质，弥漫分布于整个胞质或沿胞膜周边呈线状分布。CD34标记大肠癌组织中微血管多集中于癌灶边缘，血管缺乏完整性，管壁缺乏平滑肌。大肠癌组织中NRP-1阳性率为69.23%（36/52），MVD为（73.13±17.31），均明显高于正常大肠组织的NRP-1阳性率3.85%（2/52）和MVD（22.32±5.25），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 正常大肠和大肠癌组织的NRP-1表达及MVD比较

2.2 NRP-1的表达与大肠癌临床病理学特征的关系 在不同性别、年龄、肿瘤的部位、细胞分化程度的组别，差异无统计学意义（P＞0.05）；在肿瘤大小、淋巴结转移与否、浸润深度、不同Dukes分期组别比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2 。

表 2 大肠癌组织中NRP-1、VEGF的表达及MVD与临床病理特征的关系（x±s）

2.3 大肠癌组织中NRP-1 的表达与 MVD 的关系 见表3。

Ochsenbein等［3］最先于1987年在非洲蟾蜍神经组织中发现的一种与神经生长导向有关的细胞膜表面I型跨膜糖蛋白，称Neuropilin。NRP有两个亚型：NRP-1和NRP-2，它们结构相似，约47%氨基酸序列同源。NRP为collapsin/semaphorin 家族受体，在神经细胞导向、轴突生长方面发挥调节作用。近年研究发现，NRP-1是VEGF亚型特异性受体，能与VEGF165结合，促进肿瘤新生血管生成。

很多肿瘤，如前列腺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等，都发现有NRP-1的表达。Hansel等［4］研究发现，NRP-1在一些消化道肿瘤发生和进展过程中，随着腺体的发育异常从低到高，癌前病变组织中NRP-1表达强度和范围随之增加，提示NRP-1可能与消化道肿瘤的发生和发展有关。胡希宏等［5］对胃癌的研究也发现，NRP-1与淋巴结转移及浸润深度相关。本资料显示，NRP-1在肿瘤≥5cm组、淋巴结转移组、浆膜及浆膜外浸润组的大肠癌组织中阳性率明显升高，提示NRP-1的表达与大肠癌的肿瘤生长、淋巴结转移及肿瘤浸润有关。

新生血管的生成是肿瘤生长和转移的基础，肿瘤血管生成为肿瘤生长提供了必须的营养，促进肿瘤体积增大。另一方面，肿瘤组织内血管密度增加，促使肿瘤细胞进入血管发生转移的几率加大。MVD 反映了肿瘤组织的血管生成状态，已广泛应用于肿瘤血管生成的研究。肿瘤血管生成受多种血管生成因子和血管生成抑制物的调控，VEGF 是中心调控因子。NRP-1是VEGF165的复合受体，其生物学功能主要与VEGF165和VEGFR-2（血管内皮细胞表面受体）有关。AnaCatarina等［6］发现，内皮细胞协同表达NRP-1、VEGFR-2可加强VEGFl65与VEGFR-2的结合，增强VEGFl65介导内皮细胞趋化活性及有丝分裂原性。NRP-1是通过调节VEGF与VEGFR-2结合及其生物活性而影响VEGF诱导血管形成的［7］。Miao等［8］诱导前列腺癌细胞过度表达NRP-1的实验发现，肿瘤体积显著增大、肿瘤毛细血管密度增加、内皮细胞增殖、血管扩张。本资料显示，NRP-1阳性表达组的MVD 显著高于阴性组，表明NRP-1在大肠癌的血管生成中起促进作用。且大肠癌组织中NRP-1与VEGF共同阳性表达者占46.15 %，表达强度呈正相关。提示NRP-1促血管生成机制与VEGF有关。

综上所述，作者认为NRP-1基因的过度表达在大

表3 大肠癌组织中NRP-1的表达与 MVD 的关系（x±s）

2.4 大肠癌组织中NRP-1、VEGF 表达的相关性 NRP-1与VEGF共同阳性表达者占46.15 %（24/52），表达强度呈正相关，r=0.27，P=0.02。

3 讨论

肠癌的发生、发展过程中起一定作用，可作为评价大肠癌生物学行为的指标之一，NRP-1的表达与大肠癌的血管生成有关，因此NRP-1作为肿瘤抗血管治疗的靶点具有一定的价值。

1 Conway EM, Zwerts F, Van Eygen V, et al.Survivin-dependent angiogenes is in ischemic brain:molecular mechanisms of hypoxiainduced up regulation.Am J Pathol.2003,163(3):935～946.

2 Krishnan Kulumani Mahadevan,Debdatta Basu,Swarup Kumar. Does CD34 Staining Reflect the Angiogenic Process in the Bone Marrow? An Analysis of a Series of Chronic Myeloid Leukemia Patients. J Clin Diagn Res. 2014, 8(5): FC04～FC07.

3 Ochsenbein AM,Karaman S,Jurisic G,et al. The role of neuropilin-1/ semaphorin 3A signaling in lymphatic vessel development and maturation. Advances in Anatomy Embryology and Cell Biology.2014,214:143～152.

4 Hansel DE,Wilentz RE,Yeo CJ,et al.Expression of neuropilin-1 in high-grade dysplasia,invasive cancer,and metastases of the human gastrointestinal tract. Am J Surg Pathol. 2004,28(3):347～56.

5 胡希宏,王云忠,金桂龙,等. Neuropilin-1与胃癌发生、发展及血管生成的关系.浙江医学.2013,35(5):347～350.

6 Ana Catarina PL,Susana P,Mamede C. Roles of Vascular Endothelial Growth Factor in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Biomed Res Int. 2014,947513.

7 Neufeld G,Cohen T,Gengrinovitch S,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors.FASEB J.1999,13(1):9～22.

8 Miao H Q,Lee P,Lin H,et al.Neuropilin-1 expression by tumor cells promotes tumor angiogenesis and progression. FASEB J. 2000,14(15):2532～2539.

Objective To explore the expression of Neuropilin-1（NRP-1） in colorectal carcinoma tissue，analyze and identify the relationship between the expression and tumor angiogenesis together with biological behaviour in colorectal carcinoma. Methods SP immunohistochemical method was performed to detect the expression of NRP-1，VEGF and CD34，the value of microvascular density（MVD）in surgically resected colorectal carcinoma specimens and normal colorectal tissues was evaluated.Results The positive expression of NRP-1 and CD34 in colorectal carcinoma specimens were signifi cantly higher then in normal colorectal tissues，and also the expression and MVD were closely related to lymph node metastasis and depth of invasion. The MVD in the groups of NRP-1 positive-expression were signifi cantly higher than in negative-expression groups. There were positive correlations between the expression of NRP-1 and VEGF in colorectal carcinoma. Conclusions The expression of NRP-1 is participated to the invasion and metastasis of colorectal carcinoma. NRP-1 is participated to the tumor angiogenesis on colorectal carcinoma. NRP-1 can be selected as target for tumor anti-angiogenesis treatment.

colorectal carcinoma Neuropilin-1 Angiogenesis Immunohistochemistry

322109 浙江省东阳市人民医院外科（蔡巧英）

310009 浙江大学医学院附属第一医院肛肠外科（华汉巨）