双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立

蒋文明，李金平，于美芳，孙文博，王素春，彭 程，侯广宇，刘 朔，杜 翔，于建敏，陈继明

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250100）

双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立

蒋文明1，李金平1，于美芳1，孙文博2，王素春1，彭 程1，侯广宇1，刘 朔1，杜 翔1，于建敏1，陈继明1

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250100）

为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法，根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因序列和N9亚型流感病毒的NA基因序列，设计2对特异性引物，在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上，优化双重RT-PCR反应条件，建立同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR。对H7N9亚型流感病毒核酸模板进行双重RT-PCR扩增，结果可同时扩增HA基因263bp、NA基因520 bp的特异性片段，而对其他常见亚型的流感病毒的RT-PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明，该双重RT-PCR方法的检测下限为3 pg的H7N9病毒模板。利用该双重RT-PCR方法对30份临床样品进行H7N9病毒进行检测，与病毒分离方法进行对比，结果显示，两者的符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法，具有特异、快速、敏感、准确的特点，可用于H7N9流感病毒的同时检测和鉴别诊断，为H7N9亚型流感的有效防控提供技术支撑。

流感病毒；H7N9；双重RT-PCR

2013年以来，各地陆续暴发的H7N9流感，给我国家禽业造成了巨大的经济损失。根据中国畜牧业协会的统计数据，从H7N9暴发之后的一周之内，家禽行业的损失高达100亿。截至2013年上半年，受H7N9流感疫情影响，在短短3个月的时间内，养殖场户直接经济损失超过600亿元[1]。H7N9还严重威胁着人类的健康，目前有20多个省份发现了H7N9病例，而且病例数和死亡数还在持续增加。

目前，从家禽和环境中分离的家禽H7N9流感病毒虽然对家禽无致病力，但存在变异成高致病性毒株的风险。为加强源头控制，及时发现、逐步剔除H7N9流感病毒，切实保障畜禽产品安全和公共卫生安全，农业部组织实施了《全国家禽H7N9流感剔除计划》。因此，建立H7N9流感病毒的快速检测方法十分必要。传统的检测方法，包括分步分别鉴定HA亚型和NA亚型，或者采用流感病毒通用HA和NA基因扩增后测序的方法，或者荧光定量的方法进行检测。这些方法存在费时费力或在基层兽医实验室难以操作的缺点。因此，有必要建立一种能应用广泛、高效的检测方法。本研究建立了一种能同时鉴别H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR方法，并对该方法的特异性、敏感性和准确性进行了进一步分析。

1 材料与方法

1.1 病毒

A/chicken/K89/Jiangsu/2013（H7N9）、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H9N2等亚型的禽流感病毒均由本实验室分离保存。

1.2 主要试剂

QIAamp Viral RNA Mini Kit购自Qiagen公司，HiScript II One Step RT-PCR Kit购自Vazyme公司，DL2000 DNA Marker购自Takara公司。

1.3 引物设计

根据GenBank中发表的序列，针对流感病毒N9序列保守区设计一对引物（表1）。扩增H7的引物参考农业行业标准《禽流感病毒RT-PCR检测方法》（NY/T 772-2013）[2]。

表1 扩增H7亚型和N9亚型的引物

1.4 病毒RNA提取

根据QIAamp Viral RNA Mini Kit操作说明提取病毒RNA，置-80℃保存备用。

1.5 单重RT-PCR扩增

用引物对H7F/H7R和N9F/N9R分别进行扩增。在微量核酸分析以上测定病毒RNA的含量后，将RNA作10倍比稀释，取3.0μL稀释后的RNA模板，加入到22.0μL RT-PCR预混液中，包括12.5μL 2×RT-PCR Buffer，引物各1.0μL（10μmol/L），1.25μL Enzyme Mix，6.25μL ddH2O。RT-PCR反应条件为50℃ 30min，94℃ 2min，然后进行35个循环（94℃ 30s，50或54℃ 30s，72℃ 30s），最后72℃延伸5min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 双重RT-PCR检测方法的建立及优化

利用上述优化的两对引物建立检测H7和N9的双重RT-PCR检测方法，分别对退火温度、引物浓度等参数进行优化。

最适退火温度的确立：分别以50、51、52、53、54、55、56、57℃的退火温度进行梯度RTPCR反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳观察，根据不同退火温度下目的条带的亮度确定最适退火温度。

最适引物浓度的确立：上、下游引物终浓度分别为0.1、0.2、0.4μmol/L，进行RT-PCR反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，确定最适引物浓度。

1.7 双重RT-PCR方法的特异性

利用优化的双重RT-PCR方法分别检测H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H9N2等常见亚型的禽流感病毒，检验双重RT-PCR方法的特异性。

1.8 双重RT-PCR方法的敏感性

在微量核酸分析以上测定H7N9病毒RNA的含量后，作10倍比稀释，利用优化的双重RTPCR方法对不同稀释度的RNA进行扩增，检验双重RT-PCR方法的敏感性。

1.9 双重RT-PCR方法与病毒分离方法的比较

对30份临床样品，利用建立的双重RT-PCR方法与病毒分离的方法进行H7N9病毒检测，检验双重RT-PCR方法的准确性。

2 结果

2.1 单重RT-PCR扩增结果

从含有H7N9流感病毒的尿囊液中扩增得到H7亚型和N9亚型特异的基因片段。2.0%的琼脂糖凝胶电泳证明获得了与预期片段大小相符的条带（图1）。结果表明，H7F/H7R引物对的检测下限为300 fg，N9F/N9R引物对的检测下限为300 fg，两对引物均具有较高的检测效率。

图1 H7亚型（A）和N9亚型（B）引物对不同浓度H7N9病毒RNA模板的扩增

2.2 双重RT-PCR方法的建立及优化

通过对H7亚型和H9亚型2对特异性引物浓度及双重RT-PCR扩增温度等的优化，最后确定双重RT-PCR中最佳引物浓度分别为H7的上、下游引物各0.4 μmol/L、N9的上、下游引物各0.2 μmol/L；最佳退火温度为50℃（图2、3）。双重RT-PCR的最佳反应模式为：50℃ 30min，94℃2min，然后进行35个循环（94℃ 30s，50℃ 30s，72℃45 s），最后72℃延伸5min。

2.3 双重RT-PCR方法的特异性

利用建立的双重RT-PCR方法分别对H7N9、 H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H9N2等亚型的禽流感病毒进行检测，结果该方法只能扩增H7亚型和N9亚型的流感病毒，对其它亚型的流感病毒无扩增（图4），结果表明该方法具有良好的特异性。

图2 不同引物浓度对H7N9病毒RNA模板的扩增

图3 不同退火温度对H7N9病毒RNA模板的扩增

图4 双重RT-PCR方法对不同亚型流感病毒RNA的扩增

2.4 双重RT-PCR方法的敏感性

测定模板RNA的初始浓度为100 μg/ml。将提取的RNA依次做10倍比稀释，每个稀释度取3μL作为模板进行扩增。结果显示3 pg的H7N9可扩增出特异性条带（图5），说明该方法具有良好的敏感性。

图5 双重RT-PCR对不同浓度H7N9病毒RNA模板的扩增

2.5 双重RT-PCR方法与病毒分离方法的比较

30份临床样品中，有24份经该双重RT-PCR方法检测为阳性（图6）。通过实验室病毒分离的方法，24份样品中可以分离到病毒，两种方法的符合率为100%，说明该方法具有良好的准确性。

图6 双重RT-PCR方法对临床样品H7N9病毒核酸检测结果

3 讨论

H7N9亚型流感病毒是一种新型的流感病毒，2013年3月上海和安徽两地率先发现[3，4]，之后迅速蔓延，目前已在全国二十多个省市发现该病毒引起的病例。H7N9流感病毒在引起人感染死亡的同时，给养禽业造成了沉重打击。

在进行双重RT-PCR的研究中，引物的设计至关重要，要求所设计的引物GC含量相近，Tm值相近，确保在相同的退火温度下，不同基因片段都能得到很好的扩增。另外，引物特异性要好，尽量避免非特异性扩增，干扰结果判定。双重PCR反应在同一体系内进行，复合扩增物中的引物之间、模板之间、引物与模板之间可能存在抑制，因此，在试验过程中必须对各种条件进行优化。

针对H7N9亚型流感病毒的HA基因和NA基因保守序列，本研究设计了5套引物，通过分析其特异性和引物之间的二聚体，经反复摸索及优化引物浓度和退火温度，得到最佳的反应条件，成功筛选出适合同时检测H7亚型和N9亚型的双重RTPCR方法，一管检测既可确定H7N9亚型流感病毒，也可鉴别单个H7亚型或N9亚型流感病毒，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。

本研究所建立的双重RT-PCR的方法，对于H7亚型流感病毒和N9亚型流感病毒的检测均可出现与试验设计大小相符的条带，而对于其他亚型流感病毒的扩增结果均为阴性，表现出较好的特异性；通过敏感性试验，本方法最低能检出3 pg的H7N9亚型流感病毒模板，证明该方法的敏感性较高。与病毒分离方法相比，该方法表现出高度的准确性。

本研究建立的H7N9亚型流感病毒双重RT-PCR检测方法，具有特异性强、敏感性高、操作简单等优点，在同一反应体系中，加入2对引物，同时检测2个目的基因，一管多检，省时省力。该方法实现了对H7N9亚型流感病毒的快速检测，同时还可确定H7亚型流感病毒、N9亚型流感病毒，应用前景广阔，对H7N9流感的早期诊断和有效防控具有重要意义。

总之，本研究所建立的双重RT-PCR对于同时检测H7亚型和N9亚型流感病毒具有方便快捷、特异性良好、敏感性较高的特点，对H7N9亚型流感病毒的监测和防控有重要意义。

[1] 蒋文明. 从“H7N9禽流感”命名说开去[J].中国动物检疫，2014，8（31）：80-82.

[2] 农业部. NY/T 772-2013禽流感病毒RT-PCR检测方法[S].北京：中国标准出版社，2014-01-01．

[3] Gao R，Cao B，Hu Y，et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A （H7N9） virus[J]. N Engl J Med. 2013;368：1888-1897.

[4] Kageyama T，Fujisaki S，Takashita E，et al. Genetic analysis of novel avian A（H7N9） infl uenza viruses isolated from patients in China，February to April 2013[J]. Euro Surveill. 2013;18：20453.

Development of a Duplex RT-PCR Method for Rapid Detection of H7N9 Subtype Infl uenza Virus

Jiang Wenming1，Li Jinping1，Yu Meifang1，Sun Wenbo2，Wang Suchun1，Peng Cheng1，Hou Guangyu1，Liu Shuo1，Du Xiang1，Yu Jianmin1，Chen Jiming1
（1.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032； 2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250100）

To establish a simple and rapid method for detection of H7N9 subtype infl uenza virus，two pairs of specifi c primers were designed according to the conserved regions on the HA sequences of H7 subtype infl uenza virus and the NA sequences of N9 subtype influenza virus in GenBank. A duplex reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） method was developed for simultaneously detection of H7 subtype and N9 subtype infl uenza virus based on the single RT-PCR for H7 and N9 subtypes and on further optimization of duplex RT-PCR conditions. Amplifi cation of H7N9 subtype infl uenza virus nucleic acid template by this method showed that specifi c fragments of the 263 bp of HA gene and 458 bp of NA gene could be amplifi ed，and other common subtype infl uenza viruses in this duplex RTPCR were negative. Sensitivity test results showed that the detection limit of the duplex RT-PCR method was 3 pg H7N9 virus templates. Compared with the results of virus isolation methods for testing30 clinical samples，the duplex RTPCR method showed that the coincidence rate was 100%. It was shown that the established duplex RT-PCR method was specifi c，rapid，sensitive，and accurate and it can be used for simultaneously detection of H7N9 infl uenza virus and differential diagnosis，and it provide technical support for effective prevention and control for H7N9 subtype infl uenza.

infl uenza virus；H7N9；duplex RT-PCR

S852.65

A

1005-944X（2015）05-0065-05

青岛市科技计划14-2-4-105-jch，国家自然基金31200123