甲氨蝶呤血药浓度与患者肝肾功能指标的相关性分析

聂松柳，沈炳香，段自皞，蒋俊杰，王法财

(安徽医科大学附属六安医院药学部，安徽六安 237005)

大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)是临床治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)和骨肉瘤患者的重要化疗方案。然而，MTX体内代谢过程、血药浓度个体差异大，在抑制肿瘤细胞发挥疗效的同时也增加了对机体正常细胞的毒性，可产生严重甚至致命的毒副作用，如肾衰、肝损害、骨髓抑制、胃肠道反应、皮肤黏膜反应以及因此而引起的继发感染、出血等［1］。

MTX血药浓度监测能满足化疗方案的个体化，增加疗效，有效减少MTX的毒副作用，已为临床所公认。

本研究使用Spearman相关分析法分析了MTX 20 h和44 h血药浓度与MTX实验室肝肾功能指标之间的联系，探讨了监测MTX 20 h、MTX 44 h的血药浓度在预防甲氨蝶呤毒性中的作用。

1 仪器及试药

1.1 仪器 美国Waters公司高效液相色谱仪，梅特勒-托利多AL104、ABS135-S电子天平，梅特勒-托利多pH酸度计，飞鸽牌GL-16G-2超低温高速离心机，飞鸽牌TDL80-2B普通离心机，减压干燥箱，水浴锅，微型漩涡混合仪。

1.2 试药 对照品:MTX(批号:100138-200603)由中国药品生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯(美国TEDIA公司)，水为自制双蒸水，其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 对象 2009年11月—2014年6月入住我院成人ALL患者，接受大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)化疗+亚叶酸钙(CF)解救方案进行治疗。记录患者化疗前后血常规、肝肾功能、血糖、血脂、乳酸脱氢酶(LDH)等相关实验室检验指标。

2.2 用药方案及样本采集 MTX剂量为3～6 g·m-2，起始0.5 g在30 min内快速静脉滴注，剩余量在剩下的23.5 h内静脉维持输注。用药当天给予5%碳酸氢钠静滴，使尿液pH＞7;在化疗当天及后3 d内给予大量水化;MTX应用结束后24 h应用CF分次解救，每6 h一次，共8次，首剂加倍，解救至MTX血药浓度＜0.1μmol·L-1。血液样本分别于MTX静滴结束后0、20、44 h采集，取静脉血2 mL。

2.3 血液样本处理 血液样本3 000 r·min-1离心，分离血清。取血清200μL，加15%高氯酸30 μL，漩涡混合 1 min，15 000 r·min-1离心 10 min，吸取上清液180μL置一干净离心管中，加入4 mol·L-1NaOH 10 μL，漩涡混合30 s，取25 μL进样。

2.4 色谱条件 色谱柱:Waters symmetry柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，C18)，保护柱:Waters保护柱(20 mm ×3.9 mm，5 μm，C18);流动相:磷酸盐缓冲液(pH6.8)∶甲醇 =80∶20(V/V);流速:1.0 mL·min-1;柱温:35℃;紫外检测波长:306 nm。杭州英谱HS色谱数据工作站 V4.0+。血清中杂质对MTX检测无干扰，MTX基线分离，MTX保留时间为13.1 min，色谱分析在20 min内完成。

2.5 血清标准曲线及线性关系 MTX:精密称取MTX对照品适量，用磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解配制为200μmol·L-1原液，以MTX原液和空白血清配制浓度为 0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol·L-1标准血清样品。采用“2.2”项下方法处理进样，检测结果根据峰高(Y)和浓度(X)进行线性回归。因MTX浓度跨度大，为减少误差，分两段处理。结果，分别得回归方程:Y1=1 520.6X-34.199(r=0.999 4，n=6)和 Y2=1 517.5X-948.98(r=0.999 5，n=6)。表明本方法的甲氨蝶呤检测浓度分别在 0.05 ～2.5 μmol·L-1、2.5 ～100μmol·L-1范围内线性关系良好。

2.6 精密度测定结果 取标准液一定量同上述操作，配成 1、10、100 μmol·L-13 种浓度，每种浓度平行做3份，按前述方法提取进样，连续测定3 d，计算日内、日间精密度，结果日内、日间RSD分别为(4.0 ±1.31)%、(4.9 ±1.13)%，说明测定方法能满足血药浓度分析的要求。

2.7 提取回收率试验 取1、10、100μmol·L-13种浓度的标准液，按“2.3”项下方法操作，测定得MTX峰高H1，同时配制与各浓度质控样品相同标示量的水溶液直接进样，测定MTX峰高H2，计算各浓度样品提取回收率(提取回收率 =H1/H2×100%)，结果见表1。

表1 绝对回收率及方法回收率(n=6)

2.8 稳定性试验 取1μmol·L-1的MTX标准血样1 mL，置-20℃冻存，连续冻融3次，分别于冻存前及每次冻融后测定MTX浓度，考察冻融稳定性。结果，3次反复冻融后测定的浓度为冻融前测定浓度的(100.2±5.78)%，表明反复冻融后的样品表现较稳定。另取按“2.3”项下方法处理后的待测样品，置室温条件下考察放置稳定性。结果浓度为1 μmol·L-1的 MTX 标准血样在处理后 0、8、24 h 三个时间点测得的浓度分别为 0.996、1.003、0.998 μmol·L-1，平均(0.999 ±0.02)μmol·L-1，RSD=3.45%，说明处理后的待测样品室温放置24 h内也较稳定。

2.9 实验室质控方法 本实验室MTX血药浓度监测的方法学3个月更新一次，每次均重复本文2.5至2.8中标准曲线的制作、精密度、回收率、稳定性实验，确保标准曲线的线性关系良好。另外，在监测患者的血药浓度的过程中，我们都会测定一个已知浓度的MTX血样作为质控，以确保患者血药浓度监测的数据准确。2.5至2.8中方法学相关数据为2014年8月份最近一次的结果。

2.10 数据分析及统计学处理 所有患者按用药结束后20、44 h的MTX血药浓度与肝肾功能各项指标进行相关分析。统计学方法应用SPSS 19.0软件。计量资料以±s表示。采用Spearman相关分析两变量间相关性。

3 结果

3.1 22例次血药资料 选22例次资料齐全的ALL患者采用HD-MTX+CF方案化疗后MTX血药浓度监测的结果:用药结束后0 h的MTX有效浓度为(52.99 ±22.59)μmol·L-1，20 h 及44 h 的血药浓度分别为(3.42 ± 7.64)μmol·L-1、(0.53 ±0.99)μmol·L-1。

3.2 MTX 20 h、44 h血药浓度与肾损害的关系22例ALL患者中有9例次在20 h出现MTX体内蓄积，有10例次在44 h出现MTX体内蓄积。

Spearman相关分析显示:化疗后20 h血MTX浓度与患者化疗后肌酐(CRE)值呈正相关(r=0.657，P ＜0.01)，而与尿素氮(BUN)值、尿酸(UA)值无关，见图1。

化疗后44 h血MTX浓度也与患者化疗后CRE呈正相关(r=0.749，P ＜0.01)，而与 BUN 值、UA值无关，如图2。

3.3 MTX 20 h、44 h血药浓度与肝功能指标的关系22例ALL患者化疗后有5例次出现总胆红素(STB)偏高的现象，12例次直接胆红素(DBIL)明显升高，2例次谷草转氨酶(AST)偏高，4例次谷丙转氨酶(ALT)偏高。

Spearman相关分析显示:化疗后20 h血MTX浓度与患者化疗后 DBIL值呈正相关(r=0.562，P＜0.01)，与 STB 呈正相关(r=0.533，P ＜0.01)，与ALT值也呈正相关(r=0.450，P ＜0.05)，与 AST 呈正相关(r=0.439，P ＜0.05)，见图3 ～6。

而化疗后44h血MTX浓度与患者化疗后STB、DBIL、ALT、AST 值均无关。

4 讨论

MTX的细胞毒作用是非选择性的，在抑制肿瘤细胞的同时也增加了对机体正常细胞的毒性。为减少MTX的毒副作用，需要使用CF解救，而CF解救MTX引起的不良反应同时，也一定程度抵消了MTX的抗白血病作用。因此根据MTX的血药浓度适度适量的CF解救至关重要［2-3］。

本研究的结果显示MTX 20、44 h血药浓度与患者化疗后血CRE值呈正相关。这说明，对于ALL患者肾功能损害，MTX 20、44 h血药浓度均有明显的预测作用。另有虞国慧等的研究［4］称44 h血药浓度与化疗前血CRE值呈正相关。Holmboe等的研究［5］称MTX主要由肝脏代谢为7-OH-MTX，由肾脏主要以原型清除，MTX的排泄延迟会加重肾功能受损。我们可以推论，肾功能不全和MTX的排泄延迟是互为因果的，化疗前肾功能不全会引起MTX的排泄延迟，而MTX排泄延迟会进一步引起肾功能损害。因此，肾功能不全的患者使用MTX化疗时应慎重。如果患者出现MTX排泄延迟会应及时水化、碱化尿液、增加CF解救剂量，以缓解MTX的细胞毒性，同时检查肝肾功能指标，严重时考虑血液透析，降低血液MTX水平。给予carboxypeptidase 2(CPDG2，羧肽酶)已得到证实可在15 min内有效降低MTX水平(95.6% ～99.6%)。CPDG2通过水解MTX为无活性的代谢产物(DAMPA和谷氨酸)，而发挥作用。因此，如果能在早期给予CPDG2，可能不再需要透析治疗［6-7］。但目前，CPDG2的使用仍属研究阶段，未在临床广泛使用。

本研究的结果还显示MTX 20 h血药浓度与患者化疗后血 STB、DBIL、ALT、AST 值均呈正相关，而44 h血 MTX 浓度与 STB、DBIL、ALT、AST 值无相关性。这说明，对于应用HD-MTX化疗的ALL患者造成肝损害，MTX 20 h血药浓度监测具有预测作用。MTX造成的肝脏损害可能是急性的、可恢复的，MTX在化疗20 h时对患者造成的肝损害到第3天44 h时，随MTX的消除肝功能得到了恢复。

MTX造成不良反应的作用机理尚不完全明确。国外研究表明，HD-MTX给药后引起的急性肝脏毒性与MTX在机体内的主要代谢产物7-OH-MTX浓度有关［5］。另有研究表明，MTX治疗ALL的疗效和毒副作用可能与胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)基因(TYMS)［8-11］及丝氨酸羟甲基转移酶 1(serine hydroxymethyltransferase 1，SHMT1)［12］多态性有关。

［1］邓 蓉，沈爱宗，朱继业.甲氨喋呤的不良反应［J］.安徽医药，2008，12(9):876-877.

［2］张善堂，唐丽琴，王宁玲，等.大剂量甲氨喋呤治疗儿童ALL的血药浓度监测及其临床意义［J］.安徽医药，2009，13(10):1256-1258.

［3］罗继霞，符 莹，崔建坡.ALL患儿HD-MTX化疗后不同剂量CF解救的安全性相关性分析［J］.中国实用医药，2012，7(22):167-169.

［4］虞国慧，程千松，丁美琪，等.大剂量甲氨蝶呤治疗成人急性淋巴细胞白血病后浓度监测的临床研究［J］.安徽医学，2013，34(5):563-565.

［5］Holmboe L，Andersen AM，Morkrid L，et al.High-dose methotrexate hemotherapy:pharmaeokinetics，folate and toxicity in steosarcoma patients［J］.Br JClin Pharmacol，2012，73(1):106-114.

［6］Widemann BC，Schwartz S，Jayaprakash N，et al.Efficacy of Glucarpidase(Carboxypeptidase G2)in patients with acute kidney injury after high-dose methotrexate therapy［J］.Pharmacotherapy，2014，34(5):427-439.

［7］Tuffaha HW，Al Omar S.Glucarpidase for the treatment of lifethreatening methotrexate overdose［J］.Drugs Today(Barc)，2012，48(11):705-711.

［8］杨春兰，岳丽杰，于 洁，等.胸苷酸合成酶基因多态性与ALL儿童HD-MTX毒副作用的相关性［J］.中国肿瘤临床，2013，40(7):384-388.

［9］Vanessa da Silva Silveira V，Canalle R，Scrideli CA，et al.Polymorphisms of xenobiotic metabolizing enzymes and DNA repair genes and outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia［J］.Leuk Res，2009，33(7):898-901.

［10］Erĉulj N，Kotnik BF，Debeljak M，et al.Influence of folate pathway polymorphisms on high-dose methotrexate-related toxicity and survival in childhood acute lymphoblastic leukemia［J］.Leuk Lymphoma，2012，53(6):1096-1104.

［11］Ongaro A，De Mattei M，Della Porta MG，et al.Gene polymorphisms in folate metabolizing enzymes in adult acute lymphoblastic leukemia:effects on methotrexate-related toxicity and survival［J］.Haematologica，2009，94(10):1391-1398.

［12］丁 慧，岳丽杰，于 洁，等.SHMT1多态性与ALL儿童HDMTX不良反应的关系［J］.中国肿瘤临床，2014，41(3):162-165.