纤维素酶对甘蔗梢酶解效果研究

何晓妹　福建省龙岩市武平县中赤乡畜牧兽医站364312

纤维素酶对甘蔗梢酶解效果研究

何晓妹福建省龙岩市武平县中赤乡畜牧兽医站364312

以甘蔗梢为材料，设置1.00 IU/g、2.00 IU/g、3.00 IU/g、4.00 IU/g、5.00 IU/g和6.00 IU/g六个不同的纤维素酶添加量，研究纤维素酶对甘蔗梢的酶解效果。结果表明：（1）在0～6.00 IU/g范围内，纤维素酶水解甘蔗梢能极显著提高还原糖生成量，而且还原糖生成量随纤维素酶添加量的增加而显著提高（P＜0.01）。（2）在0～3.00 IU/g范围内，纤维素酶水解甘蔗梢能极显著降低中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量（P＜0.01），而在3.00～6.00 IU/g时，NDF和ADF的含量随纤维素酶添加量的增加而有逐步降低的趋势，但差异不显著（P＞0.05），表明纤维素酶最佳添加量为3.00 IU/g，此时NDF和ADF含量分别为61.80%、34.69%，与对照组相比分别降低了16.04%（P＜0.01）和9.68%（P＜0.01）。（3）纤维素酶不同添加量对甘蔗梢酸性不溶性灰分（AIA）、酸性洗涤木质素（ADL）、灰分（Ash）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）含量的影响均不显著（P＞0.05）。

纤维素酶甘蔗梢酶解还原糖

近年来，随着我国畜牧业的发展，饲料资源日趋紧张，因此开发利用玉米和谷物秸秆、甘蔗梢、甘蔗渣等农副产品饲料发展食草型、节粮型畜牧业不仅可节约饲料资源，而且可促进农业的良性循环。由于这些农副产品纤维含量高，消化率较低，适口性差，限制了其在畜牧生产中的利用，仅有少量的作为非常规能量饲料被利用，大多数是被丢弃或直接烧掉，不仅造成巨大的资源浪费，而且污染环境，带来公害。因此，充分利用我们有限的饲料资源，挖掘出现有饲料资源的潜力，因地制宜地开发利用非常规饲料成为解决问题的一个主要途径，同时也是当今世界饲料发展趋势之一[1]。

甘蔗是轻工业的重要原料，同时甘蔗生产在农业生产中占重要的地位，我国是世界上主要的蔗糖生产国之一[2]。甘蔗梢是收获甘蔗时砍下的顶上2～3个嫩节和青绿色叶片的统称，俗称“甘蔗尾”，是制糖业的副产品。目前生产中只能直接利用小部分，大部分用于自然肥田或晒干作燃料，利用率很低，如果这些甘蔗梢能被充分利用起来作为饲料，对当地的畜牧养殖业具有重要意义。

纤维素是地球上最丰富的可再生资源，是植物细胞壁的主要成分，占植物干重的35%～50%，由β-1,4葡萄糖苷链连接葡萄糖苷形成的线形聚合体，不溶于水，可被纤维素酶水解成葡萄糖[3]。但目前各种农作物副产品，如秸杆、秕壳、甘蔗梢等因含有大量动物难以吸收利用的纤维素而大都作为农田肥料和燃料，大部分没有被利用，而是通过微生物自然分解，参与自然界碳素循环，造成极大地浪费。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，不仅可以变废为宝，而且还可以避免环境污染，纤维素酶的研究为此开辟了一条广阔的途径[4]。

纤维素酶是降解纤维素原料生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系。一个完整的纤维素酶系至少包括3类性质不同的酶：内切葡聚（endo-1,4-β-D-glucanase，EG），外切葡聚糖酶（exo-1,4-β-D-glucannase，CBH），和β-葡聚糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）[5]。3种酶协同作用，完成对纤维素的降解，纤维素酶使纤维素转化成葡萄糖的机理和详细过程至今仍不十分清楚，被普遍接受的理论主要有3种：协同理论（Synergism）、原初反应假说（Initial degrading）和碎片理论（Fragmentation），而以协同理论最为广泛接受[6]。不同来源的纤维素酶其组成及各组分比例有较大差异，同时纤维素酶作用的底物也比较复杂，致使纤维素酶活力的测定方法很多，且方法复杂而不统一[7]。常用的方法有：CMC糖化力法[8]、CMC液化力法、滤纸糖化力法[9]、滤纸崩溃法和棉花糖化力法等[10]。

在甘蔗梢含有的各营养成分中，纤维类物质对其消化率的影响最大、最直接，根据瘤胃微生物对其利用状况，可将植物细胞分为细胞内容物和细胞壁两部分。细胞内容物的降解率可达90%以上，植物细胞壁的主要组成部分为中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF），很难被微生物利用[11]。纤维素酶能降解植物细胞壁，使胞内原生质暴露出来，提高胞内物质的消化率。Qureshi等[12]在大麦基础日粮中添加0.08%纤维素酶，显著提高了肉鸡日增重，对提高其饲用价值、消除抗营养因子具有重要意义。对我省乃至我国南方地区甘蔗梢的利用，促进饲料资源的开发与利用具有指导意义和参考价值。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1甘蔗梢甘蔗收获季节取新鲜无病虫害甘蔗梢，65℃下烘干，粉碎，过40目筛后置于棕色瓶中保存备用。

1.1.2纤维酶制剂纤维素酶购自上海楷洋生物技术有限公司。

1.1.3试剂硫酸、硫酸铜、十二烷基硫酸钠、硫酸钾为化学纯；氢氧化钠、硼酸、葡萄糖、无水乙醚、丙酮、十氢萘、无水亚硫酸钠、十六烷三甲基溴化铵、柠檬酸钠、柠檬酸、十氢萘、无水亚硫酸钠和二胺四乙酸二钠四硼酸纳为分析纯。

1.1.4试验仪器水浴恒温振荡器SHA-C；UV-2000分光光度计；AG-204梅特勒-托利多分析天平；PHS-3D型pH计；101型电热鼓风干燥箱；GL-20G-Ⅱ冷冻离心机；JK-1型远红外消煮器；半定量蒸馏装置；CXC-06粗纤维测定仪；SZF-06A粗脂肪测定仪；2ZX直联旋片式真空泵；各种规格（0.1～ 1 000μL）单道可调移液器；微型植物试样粉碎机FZ102（微型高速万能试样粉碎机）。

1.1.5溶液

1）1 mg/mL葡萄糖标准液：将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100 mg于100 mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，摇匀。4℃冰箱中保存。

2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液：准确称取3,5-二硝基水杨酸6.3 g，用少量蒸馏水溶解，然后加入2 mol/L NaOH溶液262 mL，加到500 mL含有185 g酒石酸钾钠的热溶液中，再加5 g苯酚和5 g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后定容至1 000 mL。贮于棕色瓶中，室温放置1周后使用。

3）0.05 mol/L、pH4.8柠檬酸缓冲液：取0.1 mol/L柠檬酸溶液205 mL，0.1 mol/L柠檬酸钠溶液295 mL，充分混匀，定容至1 000 mL。4℃冰箱中保存备用。

4）中性洗涤剂（30 g/L十二烷基硫酸钠）：准确称取乙二胺四乙酸二钠18.6 g和6.8 g硼酸钠一同放入1 000 mL烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解，再加入30 g十二烷基硫酸钠和10 mL乙二醇乙醚。称取4.65 g无水磷酸氢二钠置于另一烧杯中，加入少量水，微加热溶解后倒入第一个烧杯中，加入蒸馏水定容到1 000 mL，摇匀，备用。

5）酸性洗涤剂（20 g/L十六烷三甲基溴化铵）：称取20 g十六烷三甲基溴化铵，溶于1 000 mL浓度为0.5 mol/L硫酸溶液中，搅拌溶解。

6）72%硫酸溶液：734.69 mL浓硫酸，加入200 mL水中，冷却后稀释至1 000 mL。

7）0.05 moLHCl溶液：量取4.2 mL比重1.19 g加1的浓盐酸167 mL，置于1 000 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释，定容到刻度。

8）2%硼酸溶液：20 g硼酸溶于1 000 mL蒸馏水中。

9）40%氢氧化钠溶液：40 g氢氧化钠溶于100 mL蒸馏水中。

1.2试验设计采用单因子试验设计，纤维素酶添加量设6梯度，分别为1.00 IU/g、2.00 IU/g、3.00 IU/g、4.00 IU/g、5.00 IU/g和6.00 IU/g，以不添加纤维素酶的甘蔗梢粉做空白组对照，每组设3个重复。

1.3试验方法

1.3.1纤维素酶活性（滤纸酶活）测定纤维素酶活性（滤纸酶活）测定：3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）。实验做3组重复，在葡萄糖标准曲线上查找对应的葡萄糖含量，按公式计算出滤纸酶活力（IU/g）。试验设3个重复，取平均值。

滤纸酶活（IU）=

酶活单位定义：以滤纸作底物，在pH4.8、50℃下，每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活单位（IU）。

1.3.2甘蔗梢粉水解甘蔗梢粉121℃灭菌30 min，准确称取3 g，加入90 mL pH4.8柠檬酸缓冲液，然后按试验设计量添加样品酶，在50℃水浴振荡器内震荡酶解反应8 h。酶水解产物经6 000 r/ min离心，分离得酶水解糖液进行还原糖含量分析，固体部分105℃烘干，分析常规营养成分。

1.3.3还原糖的测定方法DNS法测定还原糖量，以对照组调零，测定酶解液540 nm的吸光度值，在葡萄糖标准曲线上找出对应的葡萄糖含量，以葡萄糖量作为总还原糖量。

1.3.4常规营养成分测定CP：凯氏定氮法；Ash：高温灼烧；NDF：Van Soest法；ADF：Van Soest法；EE：残余法；ALD：Van Soest法；AIA：Van Soest法。

1.4数据统计分析使用SPSS17.0统计软件对数据进行ANOVA单因子方差分析，以0.05（差异显著）、0.01（差异极显著）作为差异显著性的判断标准，试验数据以平均值±标准差的形式表示。

2　结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线葡萄糖含量及其对应的540 nm的吸光度值，见表1。根据数据绘制葡萄糖标准曲线，葡萄糖标准曲线的回归方程为：Y= 0.9271X-5.32×10-2，相关系数为0.9965。

表1　葡萄糖标准曲线数据

2.2纤维素酶滤纸酶活力滤纸酶活力的测定数据为0.00 IU、97.72 IU、98.32 IU、100.11 IU，取平均值，得出纤维素酶的活性是98.72 IU。

2.3纤维素酶水解甘蔗梢还原糖生成量酶解后各组还原糖生成量,分别为3.66±0.02 mg/mL、6.15± 0.03 mg/mL、8.44±0.04 mg/mL、8.83±0.03 mg/mL、8.99±0.03 mg/mL、9.19±0.07 mg/mL。

随着纤维素酶添加量增多，还原糖生成量也逐渐增多，且各处理组间还原糖生成量存在极显著差异（P＜0.01）。当纤维素酶添加量小于3.00 IU/g时，随着纤维素酶添加量的增加，还原糖的生成量迅速增加；当纤维素酶添加量大于3.00 IU/g时，随着纤维素酶添加量的增加，还原糖生成量仍然显著提高。

2.4纤维素酶不同添加量对甘蔗梢NDF含量的影响酶解后各处理组NDF的含量分别为73.61± 0.14%、68.42±0.32%、65.02±1.03%、61.80±0.50%、61.45±0.25%、61.10±0.53%、60.76±0.26%。各处理组的NDF含量与对照组相比均有降低，且差异极显著（P＜0.01），各处理组NDF含量与对照组相比分别降低了7.05%（P＜0.01）、11.67%（P＜0.01）、16.04%（P＜0.01）、16.52%（P＜0.01）、16.99%（P＜0.01）、17.46%（P＜0.01）。

随着纤维素酶量的增加，甘蔗梢中NDF含量随着降低，当纤维素酶添加量小于3.00 IU/g时，随着酶量增加，NDF含量迅速降低，当加酶量大于3.00 IU/g时，随着酶量增加，NDF含量有所降低但是变化不明显。表明纤维素酶最佳添加量为3.00 IU/g，此时NDF含量为61.80%。各处理组NDF含量比较分别为：第Ⅰ组和第Ⅱ组与其他各处理组差异极显著（P＜0.01），第Ⅲ组与第Ⅵ组间差异显著，其他各处理组间均差异不显著（P＞0.05）。

2.5纤维素酶不同添加量对甘蔗梢ADF含量的影响各处理组ADF的含量分别为38.41±0.12%、37.78±0.22%、36.20±0.16%、34.69±0.12%、34.72± 0.17%、34.55±0.31%、34.46±0.21%，且与对照组相比分别降低了1.64%（P＜0.01）、5.75%（P＜0.01）、9.68%（P＜0.01）、9.61%（P＜0.01）、10.05%（P＜0.01）、10.28%（P＜0.01）。

各组的ADF含量与对照组相比均有降低，且差异均极显著（P＜0.01）。而随着纤维素酶量的增加，甘蔗梢中ADF含量会随着降低，当纤维素酶添加量小于3.00 IU/g时，随着酶量增加，ADF含量迅速降低，当加酶量大于3.00 IU/g时，随着酶量增加，NDF含量有所降低但是变化不明显。各处理组ADF含量比较分别为：第Ⅰ组和第Ⅱ组与其他各处理组差异极显著（P＜0.01），其他各处理组间均差异不显著（P＞0.05）。

2.6纤维素酶不同添加量对甘蔗梢其他营养成分的影响酶解后各组AIA、ADL、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪的含量见表2。

甘蔗梢酶解后各组其他营养成分的含量见表2。各组的AIA含量与对照组相比有降低的趋势，但第Ⅱ组有较小的升高，且差异不显著（P＞0.05），各处理组AIA含量与对照组分别为0.58%（P＞0.05）、0.58%（P＞0.05）、2.91%（P＞0.05）、5.23%（P＞0.05）、2.91%（P＞0.05）、4.07%（P＞0.05）。而随着纤维素酶量的增加，各组间甘蔗梢中AIA含量随着不断变化，且各处理组间差异不显著（P＞0.05）。

表2　各组AIA、ADL、Ash、CP、EE含量

各组的ADL含量与对照组相比均有降低，但差异不显著（P＞0.05）。各处理组ADL含量与对照组相比分别降低了3.23%（P＞0.05）、2.30%（P＞0.05）、3.92%（P＞0.05）、4.61%（P＞0.05）、4.15%（P＞0.05）、4.84%（P＞0.05）。而随着纤维素酶量的增加，甘蔗梢中ADL含量随之发生变化，各处理组间差异不显著（P＞0.05）。

各组的粗灰分含量与对照组相比均有降低，但差异不显著（P＞0.05）。各处理组Ash含量与对照组分别降低了1.01%（P＞0.05）、1.22%（P＞0.05）、1.22%（P＞0.05）、1.43%（P＞0.05）、1.63%（P＞0.05）、1.83%（P＞0.05）。而随着纤维素酶量的增加，甘蔗梢中粗灰分含量有降低的趋势，但第Ⅱ组和第Ⅲ组间并没有变化，且各组间差异不显著（P＞0.05）。

各组的粗蛋白含量与对照组相比均有增加的趋势，分别为了0.16%（P＞0.05）、0.16%（P＞0.05）、0.16%（P＞0.05）、0.31%（P＞0.05）、0.31%（P＞0.05）、0.31%（P＞0.05）。而随着纤维素酶量的增加，甘蔗梢粗蛋白含量也发生变化,但第Ⅰ组、第Ⅱ组和第Ⅲ组含量相同，第Ⅳ组、第Ⅴ组和第Ⅵ组含量相同；各处理组间差异不显著（P＞0.05）。

各组的粗脂肪含量与对照组相比均有增加，分别增加了0.44%（P＞0.05）、0.44%（P＞0.05）、0.87%（P＞0.05）、0.44%（P＞0.05），第Ⅴ组与对照组粗脂肪的含量几乎没有增加（P＞0.05）、0.87%（P＞0.05）。而随着纤维素酶量的增加，甘蔗梢粗脂肪含量也随着变化，各处理组间差异不显著（P＞0.05）。

3　讨论

许维秀等[13]研究和分析了纤维素酶解稻草制还原糖工艺条件。随酶用量增加，还原糖含量明显增加。李穗宏等[14]研究了麦秸纤维素酶解法制糖，利用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定酶解液中还原糖的含量，一定的葡萄糖含量对应着一定的光密度值,二者呈良好的线性关系。王雅晶等[15]分析了常规粗饲料干物质、NDF、ADF降解率的评定及评定方法间相关关系，通过添加不同纤维素酶量对粗饲料干物质、NDF和ADF消化率的影响利用平均数和标准差制定出表格，且随着纤维素酶量增加而增大，当酶量为一定风干物质时，饲料降解率可以达到最大值。本试验结果表明：纤维素酶水解甘蔗梢能提高还原糖生成量，极显著降低NDF和ADF含量，且还原糖生成量、NDF和ADF含量受纤维素酶添加量影响，与以上研究基本一致。

4　结论

纤维素酶水解甘蔗梢能极显著提高还原糖生成量，各组与对照组相比差异极显著（P＜0.01），其他组之间同样存在极显著差异（P＜0.01），且还原糖生成量受纤维素酶添加量影响。

纤维素酶水解甘蔗梢与对照组先比能极显著降低NDF含量，各处理组NDF含量分别降低了7.05%、11.67%、16.04%、16.52%、16.99%、17.46%；各处理组NDF含量第Ⅰ组和第Ⅱ组与其他各处理组差异极显著（P＜0.01），第Ⅲ组与第Ⅵ组间差异显著，其他各处理组间均差异不显著（P＞0.05）；甘蔗梢酶解的最佳纤维素酶添加量为3.00 IU/g，此时NDF含量为61.80%，与对照组相比NDF降低了16.04%（P＜0.01）。

各组与对照组相比ADF的含量分别降低了1.64%、5.75%、9.68%、9.61%、10.05%、10.28%。各处理组ADF含量第Ⅰ组和第Ⅱ组与其他各处理组差异极显著（P＜0.01），其他各处理组间均差异不显著（P＞0.05）。甘蔗梢酶解的最佳纤维素酶添加量为3.00 IU/g，此时ADF含量为34.69%，与对照组相比ADF含量降低了9.68%（P＜0.01）。各处组甘蔗梢酶解后AIA、ADL、Ash、EE和CP含量无显著变化。

[1]谢国强,陈匡辉,吴治礼.饲料资源开发新技术研究及发展战略[J].江西农业大学学报,2000(1):113-116.

[2]杨文钰,屠乃美.作物栽培学各论（南方本）[M].北京:中国农业出版社,2003:273-281.

[3]张华锋.纤维素酶研究进展[J].现代农业科学,2009(6):25-26,39.

[4]徐兴军,张伟伟,吕建伟,等.纤维素酶酶解草食性动物饲料中秸秆产糖的效果[J].安徽农业科学,2009,37(13): 5985-5986,5996.

[5]王淑军,袁素珍,杨军,等.纤维素酶酶解稻壳的条件试验[J].微生物学通报,1995,22(6):354-357.

[6]杨洁,阿力木,李福成,等.饲用纤维素酶活力测定方法的改进[J].新疆大学学报,2005,22(3):322-324.

[7]杨友坤,朱凤香,王卫平,等.纤维素酶及其应用现状[J].安徽农学通报,2009,15(13):59-62.

[8]刘德海,杨玉华,张发旺,等.饲用纤维素酶活力测定方法的探讨[J].饲料工业,20002,23(4):34-35.

[9]白云霞,朱红祥,覃燕燕,等.纤维素酶水解糖化蔗渣浆的研究[J].造纸科学与技术,2008(6):67-70,73.

[10]何凤琴,黄婷,钱昉,等.滤纸法测定饲用纤维素酶酶活的研究[J].中国饲料,2009(13):37-41.

[11]刘妙莲,王洁.影响纤维素酶活力测定的几个因素[J].食品与发酵工业,2000,26(6):37-39.

[12]Qureshi A A,Burger W C,Yrentice N,et al.Suppression of cholesterol and stimulation of fatty acid biosynthesis in chicken livers by dietary cereals supplemented with culture filtrate of Tricboderma viride[J].J Nutr,1980,110:1014-1022.

[13]许维秀,李其京,朱圣东.稻草纤维素酶解制还原糖工艺条件研究[J].荆门职业技术学院学报,2004,19(3):5-7.

[14]李穗宏,吴大雄,李宝璋.麦秸纤维素酶解法制糖研究[J].化学工程,1998,26(1):54-57,61.

[15]王雅晶,李胜利,左奎.常规粗饲料干物质、NDF、ADF降解率的评定及评定方法间相关关系[J].中国奶牛,1999(3): 31-33.

The Study of cellulose enzyme on the effect of enzymatic hydrolysis of sugarcane tip

He Xiaomei
（Zhongchi Animal Husbandry&Veterinary Station,Wuping,Longyan 364312）

Based on the material of sugarcane tip,this paper studied effects of different concentrations of cellulose enzyme on the effect of enzymatic hydrolysis of sugarcane tip.The results showed that when the concentration was less than 6.00 IU/g,cellulose enzymatic hydrolysis of sugarcane tip could significantly improve the amount of the reducing sugar and it along with the quantity of cellulase joins increaseing to enhance(P＜0.01).However,when the concentration was between 0 and 3.00 IU/g,cellulose enzymatic hydrolysis of sugarcane tip could significantly decrease the amount of the NDF and ADF（P＜0.01）,while between 3.00 and 6.00 IU/g, the contents of the NDF and ADF had gradually decreased along with the increase of cellulose,but the difference was not significant（P＞0.05）.This was also suggested that the optimum concentration of cellulose enzyme was 3.00 IU/g and the content of NDF and ADF was 61.80%and 34.69%.In contrast with the control group,which have reduced by 16.04%（P＜0.01）and 9.68%（P＜0.01）,respectively.In addition,different concentrations of cellulose enzyme on the contents of sugarcane tip AIA,ADL,Ash,CP,EE were not significant difference(P＞0.05).

cellulose sugarcane tip enzymolysis reducing sugar

A

1003-4331（2015）05-0024-05