一株高效甲醛降解菌的分离筛选与降解特性研究

周雪媚，李玉光，陈霜玲，付慧群，姜思朋，王永阔

民政部一零一研究所，北京 100070

一株高效甲醛降解菌的分离筛选与降解特性研究

周雪媚，李玉光*，陈霜玲，付慧群，姜思朋，王永阔

民政部一零一研究所，北京 100070

甲醛是一种被广泛使用的重要化工原材料和有机溶剂，其35%～40%的水溶液是医学上和科研上常用的防腐剂。然而，甲醛作为一种原生毒素，具有强烈的致癌作用，将其释放到环境中不仅严重危害人体健康，而且具有极大的环境风险。利用微生物降解甲醛已成为治理甲醛污染的重要方法。为了获得高效的甲醛降解微生物，该研究采集北京某污水处理厂的活性污泥作为菌种分离源，利用稀释平板涂布及平板划线的方法分离纯化得到一株能以甲醛为唯一碳源生长的降解菌株，并将其命名为 MCA01（CGMCC11443）。通过对该菌株的菌落形态和菌株形态进行观察，并采用法国生物-梅里埃公司的 VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析系统及其配套的革兰氏阴性鉴定板对该菌株进行常规快速鉴定，结果显示，MCA01与恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的相似度为99%。利用PCR扩增得到菌株的16S rRNA基因，并基于测序所得序列对菌株MCA01进行了BLAST比对及系统发育分析，结果指出此分离菌株与Pseudomonas putida的同源性为100%。综合上述方法，鉴定所分离的菌株MCA01属于恶臭假单胞菌。在以甲醛为唯一碳源的基础培养基中对菌株MCA01的甲醛耐受性及降解特性进行了研究，结果显示菌株MCA01至少能耐受1 600 mg·L-1的甲醛浓度。当甲醛初始浓度≤1 000 mg·L-1时，菌株MCA01能够在12 h内完全降解溶液中的甲醛；当甲醛浓度增至1 600 mg·L-1时，菌株MCA01在24 h内对甲醛降解率为38.5%。菌株MCA01对甲醛具有良好的降解效率，该研究结果对殡仪场所内防腐废水等受甲醛污染环境的微生物治理具有较好的科学意义和应用价值。

甲醛；MCA01；恶臭假单胞菌；降解性能

ZHOU Xuemei, LI Yuguang, CHEN Shuangling, FU Huiqun, JIANG Sipeng, WANG Yongkuo. Isolation and Characterization of A Bacterial Strain with Highly Efficient of Formaldehyde Degradation [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(12): 2040-2044.

甲醛（HCHO）又名蚁醛，是最简单及最常见的醛类化合物，其分子量为 30.03。甲醛是一种广泛使用的重要化工原材料和有机溶剂（牛凤兰等，2009；刘章现等，2006），而且其35%～40%的水溶液（福尔马林）是医学上和科研上常用的防腐剂（Martín-Tereso et al.，2009；Nicola et al.，2009），被确认为有效的杀菌和消毒物质。甲醛具有高度的水溶性和与生物大分子的高度反应性（鹿院卫等，2008；周光，2003），经呼吸道吸收进入人体的甲醛可与蛋白质、氨基及DNA结合，使蛋白质变性，扰乱人体细胞的代谢；损害DNA，引起细胞核的基因突变、DNA单链内交联、DNA与蛋白质交联、抑制DNA损伤的修复。甲醛具有强烈的致癌和促癌作用，已被国际癌症研究机构列为第Ⅰ类致癌物质——对人致癌物质（李艳莉等，2003），在我国有毒化学品优先控制名单上居第二位。因此防治甲醛所带来的环境污染已刻不容缓。

目前，消除甲醛的方法主要有物理吸附、化学反应、植物净化等方法，但这些方法普遍存在降解时间长、成本高等缺点从而限制了其应用（李章良等，2011）。微生物法以环境中的微生物为材料，成本低，效果好，而且无二次污染，成为甲醛防治的重要方法之一。关于微生物降解甲醛的研究最早始于 1990年，Adroer et al.（1990）分离到的Pseudomonas putida A2能降解250 mg·L-1的甲醛。随后，国内外学者又陆续分离到数十株甲醛降解微生物，如徐云等（2010）报道从土壤中分离得到一株甲醛降解菌，该菌甲醛耐受浓度可达 6000mg·L-1，46 h可将5000 mg L-1甲醛全部降解，35 h可全部降解4000 mg·L-1甲醛；吕阳等（2007）分离出了一株甲醛降解菌假单胞菌（Pseudomonas putida），该菌72 h内对26.2 mg·L-1甲醛的降解率为90.46%；黄赛花等（2007）获得了一株甲醛降解真菌黄曲霉，它能在144 h内将1241 mg·L-1甲醛降解99.67%； Qiu et al.（2014）分离了一株Methylobacterium sp.，能耐受60000 mg·L-1的甲醛，在固定化细胞降解甲醛的反应器中，以24 h为重复批次时间，菌液浓度2000 mg·L-1的固定化细胞在反应器中能重复20次降解5000 mg·L-1的甲醛，前19次的甲醛降解率均在80%，且颗粒无破裂现象。

殡仪馆内遗体防腐废水是一种特殊的污水，除含有大量病原微生物外，还含有遗体防腐过程中排放出的大量甲醛。本研究的目的是从污水处理厂活性污泥中筛选出高效的甲醛降解菌并对其甲醛降解特性进行初步研究，旨在为其应用于殡仪场所内防腐废水的甲醛降解提供有力的菌种资源和科学依据。

1　材料和方法

1.1培养基及试剂

基本培养基（g·L-1）：KH2PO40.7，K2HPO40.85，(NH4)2SO41.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.01，FeSO4·7H2O 0.001；微量元素母液0.1 mL，pH 7.0，115 ℃灭菌30 min。

微量元素母液（g·L-1）：H3BO36.0，CoCl2·6H2O 4.0， ZnSO4·7H2O 2.0， MnCl2·4H2O 0.6，Na2MoO4·7H2O 0.6，NiCl2·6H2O 0.4，CuCl2·2H2O 0.2。

乙酰丙酮溶液：50 g 乙酸铵、6 mL 冰乙酸及0. 5 mL乙酰丙酮试剂溶于100 mL水中。此溶液在冰箱内保存至少可稳定1个月。

1.2甲醛降解菌的筛选及纯化

样品采集：从北京某污水处理厂采集活性污泥作为菌种分离源。

富集培养：将少量污泥样品置于100 mL无菌生理盐水中，加玻璃珠振荡15 min后静置，取上清液作为接种液。在装有50 mL基本培养基的250 mL培养瓶中加入终浓度为100 mg·L-1的甲醛作为唯一碳源，接入1 mL的接种液，150 r·min-1、30 ℃条件下培养24 h，得到第一代培养物；取1 mL第一代培养物接种于新的含有100 mg·L-1甲醛的基本培养基中，150 r·min-1、30 ℃摇床中培养24 h，得到第二代培养物。如此反复培养至获得第五代培养物。

菌株分离：采用稀释平板涂布法进行菌株分离。将稀释液涂布到含有100 mg·L-1甲醛的固体基本培养基平板上，于30 ℃培养箱倒置培养2 d。挑取平板上长出的单菌落，反复划线分离进行多次纯化，直至得到纯菌株。

菌株保存：将纯化得到的菌株保存在20%的甘油中，-80 ℃存放。

1.3菌种鉴定

1.3.1形态学及生理生化鉴定

将分离到的纯菌株接种于有100 mg·L-1甲醛的固体基本培养基平板上，培养24 h后，进行菌落形态观察。挑取平板上的纯菌落，利用青岛海博的革兰氏染色试剂盒（HB8278）进行革兰氏染色，并利用光学显微镜（Olympus IX71）进行菌株形态观察。挑取平板上的纯菌落，制备0.5麦氏单位浓度的菌悬液，采用法国生物-梅里埃公司的 VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析系统及其配套的革兰氏阴性鉴定板对菌株进行常规快速鉴定。

1.3.2分子生物学鉴定

利用DNA提取试剂盒（Aidlab）提取细菌基因组，以16S rRNA基因扩增通用引物27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'和1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3'（Lane，1991）进行扩增，PCR反应体系25.0 μL，其中，10×Taq Plus Reaction Buffer 2.5 μL，dNTPs（10 μmol·L-1）0.5 μL，引物（25 μmol·L-1）1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.3 μL，纯水18.7 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃1 min，72 ℃ 1 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。扩出约1.5 Kb PCR产物，送至北京中美泰和生物技术公司测序。测出的序列通过 BLAST在NCBI-GenBank进行同源性比对，选取同源性高的16S rRNA基因序列，利用Culstal X软件进行多序列比对，并利用Mega 6软件构建菌株的系统发育树。

1.4甲醛降解能力的测定

将筛选出的菌株接种于含 400、1000、1600 mg·L-1甲醛的基本培养基中，150 r·min-1、30 ℃摇床培养。于4、8、12、24 h分别吸取1 mL上述培养液进行甲醛含量测定，检测甲醛降解情况。甲醛的浓度用乙酰丙酮分光光度法测定（环境保护部，1992）。上述每个处理分别设置3个重复。

2　结果与讨论

2.1甲醛降解菌株的鉴定

2.1.1形态学及生理生化鉴定

经过分离纯化后得到一株高效甲醛降解细菌菌株，编号为MCA01。该菌株于30 ℃培养24 h，平板菌落呈圆形，直径约1～1.5 mm，边缘规则，表面光滑湿润，透明，有光泽，凸起，呈乳白色；革兰染色结果为阴性，无芽孢，菌体呈短杆状。菌落与菌株的具体形态如图1所示。

利用可靠性高的VITEK2 COMPACT全自动微生物分析系统及革兰氏阴性杆菌鉴定卡（7）对菌株MCA01进行了生理生化鉴定。鉴定与比对结果显示，MCA01与恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）相似度为99%。具体结果见表1。

图1　菌株MCA01的菌落形态和光学显微镜照片Fig. 1 Colonial morphology and optical micrograph of strain MCA01

表1　VITEK2 COMPACT系统对菌株MCA01生化鉴定结果Table 1 Biochemical identification of strain MCA01 by VITEK2 COMPACT systems

2.1.2分子生物学鉴定

以菌株MCA01的DNA为模板，利用16S rRNA基因的通用引物扩增得到1383 bp的DNA序列，该序列的GenBank登录号为KU321287。通过NCBI数据库进行BLAST比对分析，测出序列的BLAST结果显示，此分离菌株与Pseudomonas putida的同源性为 100%，与蒙氏假单胞菌的同源性为 99%。利用Mega 6软件将该菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中的 21个相关种的序列进行分析比对并构建系统发育树，结果如图2所示，分离株MCA01与Pseudomonas putida位于同一个系统发育的分支。

根据菌落及菌株形态特征、生理生化鉴定的结果以及16S rRNA基因序列分析，菌株MCA01为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。据国内外文献（Aniza，2000）报道，恶臭假单胞菌除引起动植物尸体的腐败分解外，某些菌株尚可用于甲苯、甲基对硫磷、吗啡生物碱等有机物的生物转化或生物降解。在降解甲醛的微生物中，假单胞菌是一类具有突出作用的细菌，它在净化甲醛的过程中，可以以甲醛为唯一的碳源进行生长（Adroer，1990）。近年来报道了多株属于假单胞菌属的甲醛降解菌，如Doronina et al.（1997）分离的P. alcaligenes能降解200 mg·L-1的甲醛、P. putida J3能降解450 mg·L-1的甲醛；Saeed et al.（2005）分离的 4株 P. pseudoalcaligenes（LSW、SSW、NSW和OSS）能降解1850 mg·L-1的甲醛。

2.2甲醛降解能力的测定

将筛选出的菌株MCA01接种到含100 mg·L-1甲醛的基本培养基中，于24 h后利用紫外分光光度计检测甲醛的含量，结果发现，MCA01菌株在24 h内可完全降解100 mg·L-1浓度的甲醛。

2.3甲醛的降解曲线

将MCA01菌株分别接种于含400、1000、1600 mg·L-1甲醛的基本培养基中，150 r·min-1、30 ℃摇床培养。于4、8、12、24 h分别吸取1 mL上述培养液进行甲醛含量测定，检测甲醛降解情况，结果如图3所示。MCA01菌株能在12 h内能完全降解400 mg·L-1及1000 mg·L-1的甲醛。24 h内对1600 mg·L-1的甲醛降解率为 38.5%，表明该菌株可耐受高达1600 mg·L-1的甲醛，但是高浓度的甲醛可能杀死了部分MCA01菌体，从而导致细菌生长缓慢，影响了甲醛的降解效率。与已报道的甲醛降解微生物相比，MCA01具有高的甲醛耐受性，且降解速率高。比如，李章良等（2011）分离的Pseudomonas sp. JQ-1在甲醛浓度为50 mg·L-1时，24 h内对甲醛的降解率仅为87%；Yamazaki et al.（2001）分离的Methylobacterium sp. MF1降解1200 mg·L-1的甲醛需要200 h；钟卫鸿等（2013）分离的Methylobacterium sp. XJLW 培养 52 h对 1200 mg·L-1的甲醛降解率只达到31%。由此可见，菌株Pseudomonas putida MCA01对高浓度的甲醛溶液可实现快速高效降解，为其在甲醛污染环境特别是殡仪场所内防腐废水中的应用奠定了基础。

图2　菌株MCA01的系统发育进化树图Fig. 2 Phylogenetic dendrogram based on 16S rRNA gene sequences of strain MCA01

图3　菌株MCA01对不同浓度甲醛的降解率Fig. 3 Effect of the formaldehyde concentrations on degradation rates by strain MCA01

3　结论

以甲醛为唯一碳源，从污水厂活性污泥中筛选到一株具有甲醛降解能力的菌株 MCA01。通过形态学、生理生化鉴定以及分子生物学的分析，确定该菌株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。对菌株MCA01的甲醛降解特性研究发现，当甲醛初始浓度≤1000 mg·L-1时，菌株MCA01能够在12 h内完全降解溶液中的甲醛；当甲醛浓度增至 1600 mg·L-1时，菌株MCA01在24 h内对甲醛降解率为38.5%。

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Isolation and Characterization of A Bacterial Strain with Highly Efficient of Formaldehyde Degradation

ZHOU Xuemei, LI Yuguang, CHEN Shuangling, FU Huiqun, JIANG Sipeng, WANG Yongkuo
101 Institute of the Ministry of Civil Affairs, Beijing 100070, China

Formaldehyde is a kind of important chemical raw materials and widely used organic solvent. However, as a native toxin, formaldehyde is seriously harmful to human body health, so it is very urgent to prevent and control the environmental pollution brought by the formaldehyde. Microbial degradation of formaldehyde has become one of the important methods for prevention and control of formaldehyde pollution. In order to provide technical support for the industrialized utilization of formaldehyde degrading bacteria, the activated sludge was collected from a sewage treatment plant in Beijing, as the source for selecting the efficient formaldehyde-degrading bacteria. Using liquid dilution and plate streaking methods, a purified strain that can grow with formaldehyde as the sole carbon source was obtained, and designated as MCA01. Colony of the strain was observed and cells were detected using microscope, and then the routine and rapid identification of the strain was done using French France VITEK 2 COMPACT automatic analysis system. The results showed that MCA01 has a 99% similarity to Pseudomonas putida. BLAST alignment and phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequence showed that, the new isolate has the 100% similarity to Pseudomonas putida. On the basis of the above results, it can be suggested that the new isolate belonged to Pseudomonas putida. With formaldehyde as the sole carbon source, the formaldehyde tolerance and degradation characteristics of strain MCA01 were studied. The results show that strain MCA01 could tolerate at least 1 600 mg·L-1formaldehyde concentration. When the initial formaldehyde concentration was equal to or less than 1 000 mg·L-1, strain MCA01 can fully biodegrade all the formaldehyde in the solution within 12 h. When the formaldehyde concentration increased to 1 600 mg·L-1, formaldehyde degradation rate could reach 38.5% within 24 h. In brief, strain MCA01 has good degradation efficiency to formaldehyde, and the results had great scientific significance and application value for the control of the formaldehyde pollution in the environment.

formaldehyde; strain MCA01; Pseudomonas putida; degradation characteristics

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.12.018

X172

A

1674-5906（2015）12-2040-05

“十二五”国家科技支撑计划项目（2014BAC11B03）

周雪媚（1975年生），女，研究员，博士，主要从事殡葬环境科学研究。E-mail: zxmcaur@126.com *通信作者。李玉光，E-mail: Liyuguang@126.com

2015-08-24

引用格式：周雪媚, 李玉光, 陈霜玲, 付慧群, 姜思朋, 王永阔. 一株高效甲醛降解菌的分离筛选与降解特性研究[J]. 生态环境学报, 2015, 24(12): 2040-2044.