显微介导中国对虾基因鲤体内22种金属含量的测定及初步分析

闫学春，覃东立，栾培贤，曹顶臣，何立川

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；2.淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，哈尔滨 150070；3.淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150070）

显微介导中国对虾基因鲤体内22种金属含量的测定及初步分析

闫学春1,2,3，覃东立1，栾培贤1,2,3，曹顶臣1,2,3，何立川1,2,3

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；2.淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，哈尔滨 150070；3.淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150070）

通过微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定显微介导中国对虾基因鲤和普通鲤（Common carp）肌肉中Ga、Cu、Zn、Fe、Se、Mn、Cr、Mo、Co、Ni、V、Sn、Sr、Al、Ti、Ag、W、Tl、Bi、Hg、Cd、Pb等22种金属元素的含量，比较分析显微介导中国对虾基因鲤和普通鲤肌肉中金属元素富集情况。结果表明，除显微介导中国对虾基因鲤家系C中Zn元素含量略高于普通鲤外，其他金属元素含量均低于普通鲤。统计分析表明显微介导中国对虾基因鲤对金属元素富集能力与普通鲤相比无显著差异（P＞0.05）。同时，本研究中显微介导中国对虾基因鲤和普通鲤重金属Cu、Zn、Cr、Hg、Cd、Pb含量均符合相关食品安全标准要求。

显微介导；中国对虾；鲤；金属含量

网络出版时间2015-12-25 13:11:05[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151225.1311.046.html

闫学春,覃东立,栾培贤,等.显微介导中国对虾基因鲤体内22种金属含量的测定及初步分析[J].东北农业大学学报,2015,46 (12):65-71.

Yan Xuechun,Qin Dongli,Luan Peixian,et al.Detection and pilot analysis of 22 metal in Chinese shrimp total DNA microinjected common carp(Cyprinus carpio)[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(12):65-71.(in Chinese with English abstract)

显微介导中国对虾基因鲤是将中国对虾总DNA导入鲤鱼受精卵内，通过基因组水平的远缘杂交技术改善鲤鱼品质，获得基因组水平远缘杂交鱼。鱼类远缘杂交（Distant hybridization）是鱼类育种研究基本方法之一，是通过有性杂交培育鱼类优良新品种实现鱼类间基因交流的传统育种方式[1-3]。使基因组从一条鱼转移到另一条鱼中，从而导致杂交后代表现型和基因型发生改变，在遗传育种和生物进化方面具有重要作用[4]。尽管鱼类远缘杂交比较容易，但产生杂交不育后无法杂交利用得到改良品种。显微介导远缘杂交技术可以克服远缘杂交障碍，外源基因高水平表达改善品质性状低。因此，显微介导远缘杂交技术是获得鲤鱼类品质改良新品种的可行途径。本研究以通过该技术获得品质性状优良的显微介导中国对虾基因鲤新品系为研究对象[5]，探讨实际应用效果。

鲤鱼作为人类重要动物蛋白来源，是世界淡水养殖业重要鱼类之一，随着鲤鱼产销量的提高，应考虑食用安全性。有研究表明，水生动物对金属和重金属等微量元素具有较强富集作用[6-9]。残留在水产品中有害微量元素随食物链的富集对人体健康构成威胁[10-11]。大部分重金属元素对鱼类自身的生命活动也有伤害[11-12]。因此，研究鱼体金属元素含量，既可反映鱼类生理特点，又可预测水环境中重金属元素污染状况，无论从环境监测，毒理评价还是风险评估等方面，鱼类等水产品中微量元素检测十分必要[13-16]。鱼类的重金属元素中，研究最多的是镉、锌、铜3种，其次是铅、铁[17-18]。

自1985年世界上第一条转基因鱼在我国问世以来，学者对转基因鱼开展广泛研究[19]。如孙效文等用直接显微注射法获得转全鱼基因鲤[20]；Chourrout成功地将外源生长激素基因导入虹鳟鱼受精卵，并获得转基因虹鳟鱼[21]；Chen等使用虹鳟鱼的生长基素基因eDNA片段构建转基因鲤鱼[22]。作为一种新的转基因育种技术，加快鱼类育种的速度，但随之而来的是转基因安全问题，主要包括食用安全和生态安全。有关转基因鲤的食用安全性研究已有报道[23-24]。梁利群等研究自然水域对转基因鲤同种或相近种的遗传背景影响，以及转基因鲤子代与正常鲤子代生存竞争能力，认为转大马哈鱼生长激素基因鲤具有生态安全性[25]。

本研究作为转基因鲤食用安全研究的一部分，检测分析其体内金属微量元素，以了解显微介导中国对虾基因鲤的金属元素富集状态和对池塘生态影响，同时也为显微介导中国对虾基因鲤的研究提供依据，并为其安全性评价提供借鉴。

1　材料与方法

1.1材料

测定金属元素试验材料取自黑龙江水产研究所遗传育种与生物技术研究室生产的1周龄显微介导中国对虾基因鲤和普通鲤，中国对虾转基因鲤分3个家系。3个家系和对照家系试验鱼分别饲养在4个临近的0.053 hm2池塘。试验鱼在4个池塘各取30尾。家系A、家系B和家系C的平均体重分别为190.86、197.92和224.71 g；普通鲤的平均体质量为217.39 g。

1.2仪器及试剂

仪器：电感耦合等离子体质谱仪7500CX（美国安捷伦公司），配置八级杆碰撞/反应池系统；微波消解仪MARSX（美国CEM公司）；纯水器（美国Millipore公司）。

标准品：Ga、Cu、Zn、Fe、Se、Mn、Cr、Mo、Co、Ni、V、Sn、Sr、Al、Ti、Ag、W、Tl、Bi、Hg、Cd、Pb和Au标准溶液（各1000ug·mL-1），均由国家有色金属及电子材料分析测试中心提供；硝酸、盐酸均为优级纯，由美国默克（Merck）公司提供；内标溶液（含Li、Sc、Ge、Rh、In、Tb、Lu、Bi各100 ug·mL-1）和调谐液（含Li、Y、Ce、Tl、Co各10 ug·mL-1）均由美国安捷伦公司提供；试验用水为纯水器处理的去离子水。

1.3试验方法

试验前用10%（v/v）硝酸浸泡玻璃器皿过夜后，将玻璃器皿取出，超纯水冲洗3遍，烘干备用；将10 mL质量浓度为65%硝酸加入样品消解罐中清洗，首先加盖密封消解罐，再放入微波消解仪中，按样品消化程序加热，冷却后，倒出硝酸溶液，用超纯水冲洗3次，烘干备用。

1.4样品消解

剪取试验鱼背部肌肉0.5 g，放入样品消解罐中，加入2.5 mL质量浓度65%硝酸，0.5 mL 37%盐酸和7.0 mL超纯水。微波消解程序为：微波功率1 600 W，爬升温度185℃，升温时间10.5 min，保持时间14.5 min。消解完成后，将消解液移入50 mL容量瓶中，加入内标液（100 ug·L-1）0.5 mL，Au溶液（10 mg·L-1）0.5 mL，定容至50 mL。同时做样品空白溶液。

1.5仪器分析条件

消解后样品和试剂空白用ICP-MS检测。分析前，仪器用调谐液调谐至最佳状态。典型离子7Li+和205Tl+响应值分别大于8 000-1 s和20 000 s-1，氧化物产率CeO+/Ce+＜1%，双电荷产率Ce2+/Ce+＜3%；在He碰撞模式下。典型离子59Co+和89Y+响应值均大于5 000 s-1，而离子78Ar+和75ArCl+响应值均低于30s-1，51ClO+/59Co+小于3%。仪器工作参数见表1。

表1　ICP-MS工作参数Table 1Operating parameters of ICP-MS

2　结果与分析

2.1金属元素含量水平及分析

显微介导中国对虾基因鲤的3个家系及普通鲤中Ga、Cu、Zn、Fe等22种金属元素含量检测结果见表2。Zn、Fe、Al、Cu 4种元素含量在各组中均较高，必需微量元素Zn、Fe含量高于非必需微量元素Al；有害微量元素Hg、Pb、Cd含量较低，在家系A和家系B中均未检出Pb、Cd含量。

图1是4个家系金属元素含量柱状图直观比较，22种元素中，只有16种金属元素在4个家系中全部检出。

2.2安全性评价

3个家系和对照家系肌肉中6种重金属含量检测结果见表3和图2。

根据我国水产品质量安全相关标准[26-27]规定，鱼体内Cr、Hg、Pb、Cd和Cu含量分别不得高于2.0、0.3、0.5、0.1和50 mg·kg-1（湿重）；根据联合国粮农组织提供的鱼类重金属限量标准，鱼体内Zn含量不得超过40 mg·kg-1[28]。结果表明，3个家系和对照家系肌肉中Cr、Hg、Pb、Cd、Cu、Zn平均含量均符合标准要求，均未超过标准值，且全部低于标准值的一半（见图3）。

2.3肌肉中重金属含量差异

经过统计分析，家系A中Cu、Zn、Fe、Sr、Al、Ti；家系B中Sr、Ti和家系C中Cu、Sr、Ti金属含量显著低于对照组（P＜0.05），3个家系中其他元素含量差异不显著（P＞0.05）。

表2　显微介导中国对虾基因鲤与普通鲤肌肉中金属元素含量比较Table 2Comparisons between metal contents of muscles of Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps(mg·kg-1)

图1　显微介导中国对虾基因鲤与普通鲤金属元素柱状图Fig.1Histograms of metal contents of Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps

表3　显微介导中国对虾基因鲤重金属含量及评价标准Table 3Heavy metal contents of Chinese shrimp total DNA microinjected common carp and relative assessment standards(mg·kg-1)

图2　显微介导中国对虾基因鲤与普通鲤金属元素含量比较值Fig.2Comparisons of metal contents of Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps

图3　显微介导中国对虾基因鲤与普通鲤金属元素占标准值的百分比值Fig.3The percentages of metal contents in Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps relative to the safety standards

3　讨论与结论

金属元素与人体健康关系密切，鱼类在生存过程中，既要从水和食物中吸收生命必需元素，也吸收非生命必需元素，如果有毒有害金属元素在鱼类机体过量积累，会使供人类食用的鱼类成为浓缩毒素的载体，危及人类健康。尽管许多研究表明鱼类肝脏、鳃以及其他内脏器官中残留的重金属比肌肉中高[29-32]，但由于人们通常食用鱼类肌肉组织，本研究中选择鱼体肌肉组织作为金属残留的检测对象以评价显微介导中国对虾基因鲤食用安全性。结果显示，在所测3个家系和对照家系中，重金属Cu、Zn、Cn、Hg、Cd、Pb含量符合相关食品安全标准要求。据Pourang报道导致不同种鱼肌肉中重金属含量存在差异的主要因素有：食性、生长速率、环境温度、水质硬度和盐度、年龄、性别以及金属元素间相互作用等[33]。本研究的3个家系和对照家系采自相同的养殖环境，即注入水、投喂饲料以及池塘无差异。分析原因，不同家系鱼肌肉中金属元素含量差异可能与其生长速率、食性等因素有关。摄食旺盛的鱼在快速生长时，为满足较大营养需求、快速新陈代谢和正常生理发育，对必需元素和非必需元素需求也会随之增加，吸入金属元素含量相对较多，金属元素的累积随之增多，反之金属元素含量累积相对较少。闫学春等研究金属硫蛋白基因对转基因鲤及试验动物体内重金属累积影响，分析转基因鲤与非转基因鲤体内的重金属含量，结果并未发现转基因鲤体内重金属含量增加[17]。这一点与本试验结果相同。不同之处是试验鱼所用转生长激素基因是单个基因转移，经过修饰，而本试验鱼所转总DNA是多基因的转移，是未经遗传修饰的基因。相同点是试验鱼均能克服远缘杂交障碍，均使外源DNA片段在转化受体中整合。从安全性考虑，作为未经过遗传修饰的显微介导中国对虾基因鲤风险较小。

重金属在鱼体内累积主要与生活水环境有关，同一水体，鱼类因种类、规格、重金属污染物及生存条件不同，累积状况也不同。鱼对重金属吸收积累主要通过鳃呼吸及鱼体表面吸附和消化系统吸收等，当重金属在鱼体内累积量超标时，会表现出一定毒性效应，破坏鱼体内酶活性，危害鱼类健康生长，甚至造成鱼畸变或死亡。显微介导中国对虾基因鲤与普通鲤一样，重金属类毒害作用主要体现在免疫、呼吸强度、呼吸运动、生理生化作用及对鱼类基因毒性作用影响，不仅影响鱼类正常生长发育，还通过生物链作用进一步威胁人类健康[18]。

本试验表明，显微介导中国对虾基因鲤与普通鲤相比并没有显著差异，说明中国对虾总DNA渗入仅起改善鲤鱼品质作用，并没有增加显微介导中国对虾基因鲤鱼体内重金属元素富集。

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Detection and pilot analysis of 22 metal in Chinese shrimp total DNA microinjected common carp(Cyprinus carpio)

YAN Xuechun1,2,3,QIN Dongli1, LUAN Peixian1,2,3,CAO Dingchen1,2,3,HE Lichuan1,2,3(1.Heilongjiang River Fisheries Research Institue,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.National Local Joint Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding,Harbin 150070，China;3.Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Genetic Breeding,Harbin 150070,China)

The metal contents(Ga,Cu,Zn,Fe,Se,Mn,Cr,Mo,Co,Ni,V,Sn,Sr,Al,Ti,Ag,W,Tl, Bi,Hg,Cd,Pb)of muscles of both Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps were determined by microwave digestion-inductively coupled plasma mass spectrometry,and then the metal contents of muscles were compared between these common carps.The results showed that metal contents of microinjected common carp were generally less than these of usual common carp, except the Zn content in family C of microinjected common carp was slightly more than it in usual common carp.The statistical analysis suggested that there was no significant difference(P＞0.05)between microinjected and usual common carps on the enrichment of metal in muscles.Meanwhile,the heavy metal contents(Cu,Zn,Cr,Hg,Cd,Pb)of both microinjected common carp and usual common carp complied with relevant food safety standards.

microinjection;common carp(Cyprinus carpio);Chinese shrimp(Fenneropenaeus chinensis);metal content

S917.4

A

1005-9369（2015）12-0065-07

2015-06-15

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA100404）；淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室开放课题（2014NLJELFFB-03）

闫学春（1964-），男，研究员，研究方向为分子生物学与基因工程育种。E-mail:yanxc8@163．com