蜂毒注射液对前列腺癌细胞凋亡的影响研究

吕立国 张 娴 吴巧玲 陈志强 白遵光 王昭辉 代睿欣 王树声

前列腺癌是世界范围内发病率排名第二的男性恶性肿瘤［1］，确诊时多为晚期，内分泌治疗后几乎都会发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，中位生存期短。如何延缓晚期前列腺癌进展为CRPC、如何延长CRPC 生存期，是世界范围内的治疗难点。中医药治疗CRPC 逐渐成为研究的热点。初步临床研究显示，以蜂毒为主要作用成分的蜂针疗法在控制前列腺癌进展方面有一定的作用［2］，初步的实验研究显示，蜂毒对前列腺癌细胞具有凋亡诱导作用［3］。本研究拟在前期临床与实验研究的基础上，进一步探究蜂毒对PC-3 细胞凋亡的影响及其作用机理，为进一步的临床应用提供理论依据，为CRPC 的治疗提供思路。

1.材料和方法

1.1 试验药物 蜂毒注射液，购于长春博奥生化制药有限公司，批号:20120301。

1.2 细胞 前列腺癌细胞PC-3 购于中山大学实验动物中心细胞实验室。

1.3 试剂 MEM 培养基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液(Gibco 公司);四氮甲基唑蓝(MTT，美国Sigma 公司)、Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒、Fluo-3AM(南京凯基生物公司)。

1.4 仪器 多功能免疫分析仪(Perkin Elmer，VICTORTMX5)，荧光倒置显微镜(Leica，DMI2500)，流式细胞仪(Beckman Coulter，FC500)。

1.5 方法 前列腺癌细胞用含5%FBS 的DMEM，均在37℃，5% CO2，饱和湿度恒温培养箱培养，0.25%胰酶消化传代。实验设蜂毒注射液不同浓度组和空白对照组。

1.5.1 MTT 实验:细胞消化后计数，接种至96 孔培养板，每孔100μl，设4 个复孔，细胞贴壁后加入作用药物蜂毒注射液，设FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，20μg/ml，24μg/ml 作用到时间点，后加入5% MTT 溶液20μl，继续培养4 小时，吸去上清，每孔加入100μL DMSO 溶液，振荡溶解后酶标仪检测570nm OD 值。

1.5.2 Annexin V/PI 双标记流式细胞术检测细胞凋亡:设FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml 和空白对照组，细胞接种于6 孔板中，细胞贴壁后加入药物处理24 小时，收集细胞300×g 离心5 分钟，弃上清，加入500μL 结合缓冲液，5μL Annexin-FITC 和5μL PI 染液，避光孵育15 分钟后上机细胞凋亡率。

1.5.3 Hoechst33258 凋亡染色:设组和前处理同1.5.2，后加入Hoechest33258 染液，后在倒置显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.5.4 流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度:细胞接种于6孔板中细胞贴壁后加入药物处理24 小时，加入Fluo-3-Am 至10μmol/L，置二氧化碳培养箱中孵育30 分钟，收集细胞，RCF300×g 离心，去掉多余的染料。再用D-PBS 洗涤2 次，后用D-PBS 重悬细胞上机检测，检测荧光强度，以此分析Ca2+浓度。

2.结果

2.1 MTT 实验结果 由图1 可见，与空白对照组比较，FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml 组，OD 值无明显差异，FD8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，20μg/ml，24μg/ml 组OD 值均降低，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。

图1 FD 对前列腺癌PC-3 细胞活性的影响

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 由图2 可见，与空白对照组比较，FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml 组，无明显差异，FD8μg/ml 作用24 小时后细胞凋亡明显增多，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

图2 流式细胞术检测FD 对前列腺癌PC-3 细胞凋亡的影响

图3 FD 对前列腺癌PC-3 细胞凋亡的影响

2.3 Hoechst 33258 由图4 可见，与空白对照组比较，FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml 组无明显变化，FD8μg/ml 作用24小时后在荧光显微镜下能见凋亡细胞增多。

图4 FD 对前列腺癌PC-3 细胞凋亡影响(Hoechst 33258 染色)

2.4 流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度 从图5 可以看到，在FD4μg/ml，8μg/ml 处理后，细胞内Ca2+浓度明显增高，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)，尤其以FD8μg/ml 组最为显著。

图5 FD 对前列腺癌PC-3 细胞内Ca2+浓度影响

3.讨论

蜂针疗法是中医传统疗法，具有抗肿瘤的作用，临床研究显示，蜂针疗法在控制前列腺癌进展方面有明确的作用。蜂毒肽是蜂毒的主要成分，实验研究证实蜂毒肽对前列腺癌细胞具有增殖抑制、凋亡诱导作用［3］。临床与实验研究均证实了蜂毒的疗效，鉴于蜂针疗法、蜂毒肽临床应用的局限性，我们选取了由蜂毒提取制成的已批准的临床药品蜂毒注射液进行了上述实验研究，为进一步拓展蜂毒的临床应用提供依据。

本实验表明，蜂毒注射液在8μg/ml 以上浓度时，前列腺癌PC-3 细胞增殖抑制明显，进一步的流式细胞术及Hoechst 33258 染色荧光显微镜观察证实，蜂毒注射液在8μg/ml 以上浓度，作用24 小时后细胞凋亡明显增多，由此证实，蜂毒注射液可以诱导前列腺癌细胞凋亡。

既往实验已证实p27、p53 是蜂毒诱导前列腺癌PC-3 细胞凋亡的途径之一［3］。肿瘤细胞凋亡的机理是多方面的。实验测定了前列腺癌细胞内Ca2+浓度，发现4μg/ml，8μg/ml 浓度的蜂毒注射液可以引起PC-3 细胞内Ca2+浓度明显升高。

钙离子与细胞凋亡之间关系密切。凋亡的调控由十分复杂的信号网络系统控制，目前已知有三条主要信号通路:线粒体通路、内质网通路、死亡受体通路，大部分与钙离子有关。在钙离子信号与肿瘤细胞凋亡的三条通路中，存在相互促进、互为因果的促凋亡蛋白酶，加速肿瘤细胞凋亡。钙稳态的破坏可以诱导前列腺癌细胞的凋亡［4］，通过升高胞质内的Ca2+浓度，可激活相关凋亡活化因子，可促进前列腺癌细胞的凋亡［5］。由此推测，蜂毒注射液可以导致前列腺癌细胞内Ca2+超载，诱导其凋亡。

本实验在揭示了蜂毒注射液对前列腺癌细胞的凋亡诱导作用及部分可能的机制，为蜂毒注射液临床治疗前列腺癌提供了理论依据，为CRPC 的治疗提供了思路。蜂毒注射液在体内应用是否具有明确的作用，有待进一步的深入研究。

1 那彦群，叶章群，孙颖浩，等.中国泌尿外科疾病诊断治疗指南:2014 版［M］.北京:人民卫生出版社，2013:61.

2 吕立国，陈志强，吴巧玲，等.蜂针疗法治疗前列腺癌的临床应用［J］.新中医，2014，46(12):254-255.

3 吕立国，白遵光，张娴，等.蜂毒肽对前列腺癌PC-3 细胞凋亡诱导的影响［J］.中国男科学杂志，2014，28(9):13-16.

4 邝祥醒，李本义.L 型钙离子通道与前列腺癌的研究进展［J］.现代泌尿生殖肿瘤杂志，2013，5(4):249-251.

5 李玉.钙离子通道在前列腺疾病的研究进展［J］.国际泌尿系统杂志，2009，29(3):370-376.