PCR 技术在肺癌微转移中的应用现状

欧阳伟炜 李卓玲 苏胜发 卢 冰

肺癌是发生率和病死率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。随着手术方式、放疗技术的改进，化疗方案的日趋成熟，基因、生物治疗的开展，使肺癌的综合治疗达到了一个新的水平。但是肺癌患者在原发肿瘤切除后仍出现肿瘤复发和远处转移，其总的5 年生存率没有明显提高［1］。近年来，许多研究者认为肺癌微转移是引起肿瘤复发和转移的主要原因。早期发现微转移对非小细胞肺癌( non-small cell lung cancer，NSCLC) 更精确的分子分期、制定综合的治疗方案、预后判断提供依据［2］。肺癌微转移是指恶性肿瘤发展过程中，播散并存在于血液循环、淋巴道、骨髓及各组织器官中的肿瘤细胞，尚未形成转移性结节，且无任何临床表现，常规病理学、普通影像学等方法难以发现和检测到的转移。目前检测微转移的方法有很多，包括HE 连续切片法、免疫组织化学法( immunohistochemistry，IHC) 、聚 合 酶 链 式 反 应( polymerase chain reactions，PCR) 技术、流式细胞术、PET-CT 检查等方法。本文主要对近年PCR 技术在肺癌微转移中的应用情况进行综述。

一、PCR 技术概念

PCR 技术是一种分子生物学技术，PCR 种类包括PCR、反转录PCR、荧光定量PCR、反向PCR、不对称PCR、多重PCR、巢式PCR、递减PCR。PCR 技术的影响因素很多，包括模板、引物、循环温度、循环次数、反转录酶、镁离子浓度、RNA 酶被污染等，在实验中要特别注意这些因素对实验结果的影响。目前肺癌微转移主要应用3 种技术，以下对这3 种技术进行说明。

1.PCR：PCR 是选择性的体外快速扩增DNA 或RNA 片段的方法，以母链DNA 为模板，在DNA 聚合酶的催化下，以特定引物为延伸点，通过变性、退火、延伸等步骤复制出与母链DNA 互补的子链DNA 的过程。PCR 是一项DNA 体外合成放大技术，它能在数小时内将目的基因片段扩增106～8倍。PCR 技术常用于检测肿瘤细胞中的基因突变、染色体重排等DNA 异常。Kishimoto 等［3］用PCR -SSCP 法检测了115 例NSCLC 手术切除后常规病理检查无转移淋巴结的p53 突变，结果显示52% p53 基因突变阳性，提示有NSCLC 微转移的存在。

2.反转录聚合酶链式反应技术( reverse transcriptase polymerase chain reactions，RT -PCR) ： RT -PCR 是以RNA 为模板，反转录为cDNA 后，再进行PCR 扩增。通过检测待检组织中的肿瘤标志物mRNA 来证实肿瘤细胞的存在，敏感度可以大大提高，目前是公认诊断NSCLC 微转移最常用、最敏感的方法。Jiang 等［4］对有胸腔积液的肺癌患者通过RT -PCR 技术，检测甲状腺转录因子1( thyroid transcription factor 1，TTF -1) mRNA，发现TTF -1 mRNA 可以作为肺癌胸膜微转移的分子标志物，能诊断合并胸腔积液的肺癌，特别是原发性肺腺癌。

3. 荧光定量PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ - PCR ) ： FQ - PCR 是 在RT-PCR 反应体系中加入荧光标记的探针，该探针能与扩增基因的某一区域的序列发生特异性结合，实现对PCR 扩增产物的动态监测和自动定量，因而FQPCR 又称实时定量PCR( real time quantitative，PCR)或反转录实时PCR( real -time RT -PCR 或quantitative real-time RT-PCR) ，亦有人称为QPCR( quantitative PCR) 或RT - QPCR( reverse transcriptase -quantitative polymerase chain reactions) 。Saintigny等［5］应用real-time RT-PCR 技术，以细胞角蛋白7( cytokeratin 7，CK7) 、CK19、黏蛋白1( mucin type 1，MUC1) mRNA 检测19 例NSCLC 患者，29 例健康人，17 例肺部良性疾病患者。19 例NSCLC 中4 例明确有NSCLC 微转移，6 例明确有NSCLC 转移及19 例NSCLC 中有84 枚常规病理阴性淋巴结。健康人及肺良性疾病CK19、CK7、MUC1 均为阴性，4 例NSCLC微转移及6 例NSCLC 明确转移至少能检测出上述标志物中的一个阳性，84 枚常规病理阴性淋巴结7%至少能检测出上述标志物中的一个阳性，预后评估待进一步随访研究。Saintigny 等还指出 CK19 及CK7mRNA 有很高的敏感度，认为是检测肺癌淋巴结及骨髓微转移的金标准，但是CK19 特异性较低。Song 等［6］认为检测出CK19 mRNA 与肺癌的转移和复发相关。

二、PCR 技术在肺癌微转移检测中应用的意义

1.提高诊断的准确性：肺癌患者微转移病灶的检测，可以补充病理的TNM 分期，精确到分子生物学分期，能提高诊断的准确性。Yarbro［7］提到NSCLC 患者外科手术后病理TNM 分期是分期的金标准，可以作为一个重要的预后因素。Perng 等［8］提到虽然多数研究者认为手术的病理分期是诊断的标准，但是该研究者却认为病理学的TNM 分期不能令人完全满意，不能准确的评估生存率。Qiu 等［9］对早期NSCLC根治术后病理学阴性淋巴结应用FQ-PCR 技术检测癌胚抗原( carcino - embryonic antigen，CEA) mRNA，IHC 检测p53、AE1/AE3。发现FQ-PCR 检测193 枚病理学阴性淋巴结有32 枚( 16.6%) CEA mRNA 阳性表达。应用FQ -PCR 技术检测CEA mRNA 的表达能检测ⅠNO期病理学阴性淋巴结的NSCLC 患者的微转移。CEA mRNA、p53、AE1/AE3 阳性者无病生存期明显低于阴性者。该研究表明早期NSCLC CEA mRNA、p53、AE1/AE3 的联合检测可以提高准确的N 分期，提高诊断的准确性，能提供重要的预后信息。Ⅰ期NSCLC 微转移通过FQ -PCR 的检测比IHC 敏感。前哨淋巴结( sentinel lymph node，SLN) 是原发肿瘤引流区域淋巴结中的特殊淋巴结，是原发肿瘤发生淋巴结转移所必经的第1 站淋巴结，及早检测SLN 能明确患者分期、指导治疗、评估复发风险。Melfi 等［10］通过RT-PCR 技术检测16 例患者前哨淋巴结CK19 和CK7 检测出6 例出现肺癌微转移。有1 例病理检测肺癌微转移阴性的患者用RT -PCR 检测出肺癌微转移，该例患者在手术后3 个月出现复发。SLN 用RT-PCR 能提高NO期的肺癌微转移检出率，能提高诊断的准确性。

有研究认为DVL -3 和δ -catenin 在肺癌中能异常表达，影响转移［11，12］。Li 等［13］应用RT - PCR技术，检测75 例有胸腔积液的肺癌患者和51 例有胸腔积液的肺部良性疾病患者的DVL-3 mRNA 和δcatenin mRNA，结果显示对比良性疾病DVL -3 mRNA 和δ -catenin mRNA 在恶性病变有显著增高，特别是在肺腺癌中呈高表达。DVL -3 mRNA 在肺癌中有很高的特异性( 94. 1%) ，阳性预测值( positive predictive value，PPV) 高达95.7%，δ -catenin mRNA有很高的敏感度(92.0%) ，阴性预测值( negative predictive value，NPV) 达到88.5%。当两者联合评价时敏感度 100.0%，NPV 为 100.0%，准确度为96.0%。DVL-3 mRNA 和δ-catenin mRNA 能作为胸膜微转移的分子标志物，能诊断有胸腔积液肺癌患者的微转移。Li 等［14］收集44 例Ⅰ期NSCLC 患者的原发肿瘤及病理学阴性淋巴结，应用RT -PCR 技术检测surviving mRNA 和livin mRNA，发现surviving mRNA 在44 例原发肿瘤中均表达，livin mRNA 在44例原发肿瘤中有39 例表达，livin mRNA 和( 或) surviving mRNA 阳性表达的Ⅰ期NSCLC 患者15 例(34.1%) 存在NSCLC 淋巴结微转移。RT -PCR 技术检测surviving mRNA 和livin mRNA 阳性表达者较阴性表达者有很高的风险导致肿瘤复发和肿瘤相关死亡，无病生存率和总生存率明显下降。surviving mRNA 和livin mRNA 能作为分子诊断标志物用于检测Ⅰ期NSCLC 淋巴结微转移，提高诊断NSCLC 微转移的准确性。

Oddmund 等［15］应用实时RT-PCR 技术，发现表面活性蛋白C( surfactant protein C，SFTPC) 在正常淋巴结不表达，在NSCLC 肿瘤细胞的淋巴结高表达。CK19 mRNA 在NSCLC 肿瘤细胞的淋巴结对比正常淋巴结呈高表达，SFTPC 和CK19 mRNA 是检测NSCLC 局部淋巴结微转移的标志。Mohajeri 等［16］应用PCR 技术和IHC 对41 例NSCLC 患者进行骨髓微转移检测。PCR 技术检测出14 例( 34%) 阳性，IHC检测出2 例(4.8%) 阳性，表明PCR 能作为肺癌骨髓微转移检测的方法，PCR 技术比IHC 更能提高诊断的准确性。EGFR( the epidermal growth factor receptor) 是上皮生长因子细胞增殖和信号转导的受体，在NSCLC 患者中过度表达。Zhang 等［17］应用RT-PCR技术检测42 例NSCLC 患者和对照组40 例健康人的外周血的EGFR 的mRNA 表达水平，EGFR mRNA 的阳性率患者占69%，健康人占12.5%，差异有统计学意义( P ＜0.05) 。结果表明外周血的EGFR mRNA表达水平能诊断NSCLC 微转移，有重要的临床价值，能了解肺癌的预后。外科操作可以促进血液转移，Song 等［6］应用FQ-RT-PCR 技术检测30 例NSCLC肺切除术的患者CD44v6 mRNA，CD44v6 基因在NSCLC 患者静脉血的表达明显高于健康者。CD44v6基因表达在肺切除术的晚期明显高于早期。VEGFA、VEGF -C、VEGF -D、VEGF -3 是促进实体肿瘤淋巴管生成的重要信号，通过这些淋巴结发生肿瘤转移。Nwogu 等［18］应用RT - PCR 对NSCLC 患者检测，发现VEGF-A、VEGF -C、VEGF -D、VEGF 受体-3 在高表达的淋巴结中存在微转移。NSCLC 微转移与淋巴结的VEGF-A/C/D 或VEGF-受体-3 表达水平有相关性。

2.指导治疗： 肺癌患者通过PCR 技术能检测早期患者微转移，早期诊断，早期治疗，防止肿瘤的复发和转移。Sienel 等［19］认为黑色素瘤抗原基因- A( melanoma antigen gene，MAGE -A) 在肿瘤组织表达，但在正常组织不表达，是一种微转移标志物。该研究应用RT-PCR 技术对50 例可手术没有远处转移的NSCLC 患者骨髓穿刺进行MAGE -A 检测，有52%患者在原发肿瘤切除后仍有MAGE -A 表达，包括MAGE-A1、MAGE -A2、MAGE -A3/6、MAGE -A4、MAGE-A12。表明MAGE -A 转录与NSCLC 微转移相关，影响预后。该研究认为，标志物代表了潜在的治疗靶点，不仅需要用标志物检测微转移，而且需要根除标志物，以防止肿瘤转移复发。因此将辅助性抗MAGE-A 免疫治疗用于双盲、随机Ⅱ期临床研究，182 例MAGE -A3 阳性表达完整手术切除的ⅠB/Ⅱ期NSCLC 患者用重组MAGE -A3 蛋白和一种免疫佐剂治疗，随访21 个月，发现免疫治疗组(30%) 复发，安慰剂组(41%) 复发，降低了复发率。

3.判断预后：微转移会引起复发，使患者预后更差。肺癌的复发可能是在疾病早期没有系统的监测微转移引起的。肺癌微转移患者不仅有很高的复发率和肿瘤相关的病死率，而且无病生存期和总生存期显著降低。Xi 等［20］通过微阵列检查肿瘤基因表达谱可以显示淋巴结转移状态，认为肺癌淋巴结微转移导致预后差。Benlloch 等［21］对Ⅰ期NSCLC 病理学阴性淋巴结进行检测，通过real -time RT -PCR 技术，检测癌胚抗原相关细胞黏附分子5( carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5，CEACAM5)和腭肺鼻上皮癌相关蛋白( palate lung and nasal epithelium carcinoma associated protein，PLUNC) 。发现CEACAM5 和PLUNC 在肿瘤组织中能够表达，在良性组织中不表达，或者低表达。检测344 枚淋巴结中13% CEACAM5 阳性，16% PLUNC 阳性。因此检测CEACAM5、PLUNC 能评估NSCLC 病理学阴性的淋巴结是否存在NSCLC 微转移，比现在常用的TNM 分期方法能更精确的评估复发的风险，对判断预后有重要的意义。Dai 等［22］对Ⅰ～Ⅱb 期NSCLC 根治切除术后患者，应用RT -PCR 技术检测，发现NSCLC 淋巴结微转移应用RT-PCR 技术能检测出脆性组氨酸三联体基因( fragile histidine triad，FHIT) 和细胞周期依赖性激酶抑制基因( cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A) mRNA 缺失，FHIT 或CDKN2A mRNA缺失者较未缺失者更易复发，5 年的无病生存率和总生存率降低，能预测肿瘤的复发和判断预后，该研究表明NSCLC 淋巴结微转移患者降低了无病生存率和总生存率，NSCLC 淋巴结微转移是一个独立预测指标，表示预后差。

Nosotti 等［23］应用real-time RT-PCR 技术对55例已行外科手术的Ⅰ期NSCLC 患者进行检测，利用CEA mRNA 标记，发现CEA mRNA 在20 例(36.3%)患者存在肿瘤细胞，提示存在NSCLC 淋巴结微转移。CEA mRNA 阳性患者对比CEA mRNA 阴性者在生存率和无病生存率上有显著性的差异。多因素分析证实了NSCLC 微转移是一个独立预测指标，患者有更短的无病生存率。谭思创等［24］收集43 例NSCLC 患者作为实验组，15 例良性肺部病变患者作为对照组进行实验，通过RT -PCR 检测肺组织特异性蛋白X( lung-specific X protein，LUNX) mRNA 的表达，实验组43 例患者的87 枚淋巴结中有33 枚( 37. 93%)LUNXmRNA 表达，对照组15 例患者的26 枚淋巴结中有2 枚(7.69%) 表达，两组比较，差异有统计学意义( P ＜0.05) ，RT -PCR 检测LUNXmRNA 对比常规病理切片检查LUNX mRNA 检测有较高的敏感度。LUNX mRNA 是检测肺癌微转移的一个有价值的指标，可为今后制定治疗方案、评估预后提供重要参考依据。

三、展 望

肺癌微转移是引起复发和转移的重要因素，即使微转移灶再小，甚至只有一个肿瘤细胞，只要它具有转移肿瘤细胞的生物学特性就可以作为疾病处于进展期的标志物，和含有较多肿瘤细胞的大的转移灶一样能说明预后较差。临床上常规病理学和影像学检查只能发现较为明显的转移灶，而不能用于检测微转移。微转移的检测对判断患者的复发、转移及预后有着重要的意义。随着科学技术的发展，PCR 技术被广泛的应用于肺癌微转移的检测，能够提高诊断肺癌的准确性，判断预后，指导治疗。目前PCR 技术在肺癌微转移的应用存在的主要问题是：检测肺癌微转移的标志物尚无统一的标准； 尚无微转移分期的金标准；尚无统一治疗微转移的标准治疗方案，因此未来研究方向仍然主要是寻找最敏感、最特异的分子标志物，确定微转移的分期及治疗手段。

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