复方风柜斗草对小鼠急性肝损伤的保护作用

陈美惠，石鹤坤，侯中华，陈开杰，林小凤，王曙东，陈锦珊

复方风柜斗草由中药风柜斗草和向天盏组成［1］，风柜斗草(Sarcopyramis nepalensis Wall)又名肉穗草、风鼓斗草，来源于野牡丹科植物肉穗草属楮头红的全草，其性平、味甘，具有凉热解毒、凉血利水、去肝火、清肺热的功效，用于急性肝炎、肺热咳嗽、风湿痹痛、耳鸣耳聋及目雾羞明等治疗。廖梅等［2］报道风柜斗草的正丁醇提取部分具有抑制四氯化碳(CCl4)所致肝损伤所引起的转氨酶升高的作用。向天盏(Scutellaria indica L.)又名韩信草、大力草、耳挖草(《生草药性备要》)、金茶匙(《本草求原》)、顺经草(贵州)、大叶半枝莲(广西)、虎咬癀(福建)，为唇形科植物向天盏的全草，主要分布于江南各省区，其味辛、微苦、性凉，归肺、肝经，有清热解毒、利水消肿、止痛的功效［3］。本实验采用以上两药合用，探讨其保护小鼠急性肝损伤的作用，为进一步研究该药提供实验依据。

1 材料

1.1 药物 复方风柜斗草醇提取物，由南京军区南京总医院制剂科提供(批号:20140620)，联苯双酯滴丸(浙江万邦药业股份有限公司，批号:A02130212)。

1.2 试剂 丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒、总胆红素(T-BIL)测定试剂盒、直接胆红素(D-BIL)测定试剂盒购于上海复星长征医学科学有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。CCl4购于天津市福晨化学试剂有限公司，羧甲基纤维素钠(CMCNa)购于西陇化工股份有限公司，冰乙酸为天津市福晨化学试剂有限公司生产，无水乙醇为广东光华科技股份有限公司生产，以上试剂均为分析纯。大豆油购于中粮东州粮食工业(广州)有限公司。

1.3 仪器 ADVIA2400全自动生化分析仪(德国西门子公司)、UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司)、Pico-17高速离心机(美国赛默飞世尔公司)、BS223S电子天平(德国赛多利斯集团公司)、Model 680酶标仪(美国伯乐生命医学有限公司)、MS3 digital震摇器(德国IKA工业公司)、420-A型恒温水浴箱(姜堰市新康医疗器械有限公司)。

1.4 实验动物 健康清洁级ICR种小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供［许可证号:SCXK(沪)2012-0002］，动物实验环境及设施符合《中华人民共和国实验动物规范》(GB14925-95)。动物实验在厦门大学附属东南医院实验室进行［许可证号:SYXK(军)2012-0054］，符合伦理准则，获得实验动物伦理委员会批准，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。试验前适应性饲养3 d，自由摄食饮水。

2 方法

2.1 分组与给药 ICR种小鼠60只，随机分为空白组、CCl4模型组、复方风柜斗草低剂量组、中剂量组、高剂量组、联苯双酯阳性对照组，每组10只，雌雄各半。复方风柜斗草给药的高剂量为8.8 g/kg生药，中剂量4.4 g/kg生药、低剂量2.2 g/kg生药;阳性对照组给药剂量为0.2 g/kg，灌胃给药体积0.4 mL/10 g，1次/d，连续给药10 d;空白对照组和模型组给予1%羧甲基纤维素钠CMC-Na水溶液。

2.2 造模与取材测定 末次给药后0.5 h，除空白对照组腹腔注射等量大豆油外，其余各组小鼠腹腔注射0.1%CCl4大豆油溶液(0.1 mL/10 g体重)，制备CCl4急性肝损伤模型。24 h后，各组小鼠称体重，摘眼球取血，静置1 h，离心半径15 cm，3500 r/min离心10 min后分离血清，严格按试剂盒说明书检测T-BIL、D-BIL、ALT及AST活性。小鼠处死后，立即取肝脏于预冷等渗盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称定质量，计算肝脏指数［4］，并称取0.8～1 g，加入9倍量预冷等渗盐水制成10%肝组织匀浆，匀浆液以4000 r/min(离心半径15 cm)离心10 min，取上清液，测定SOD活性和MDA的含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，T-BIL、D-BIL、ALT、AST、MDA、SOD 等实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较使用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 复方风柜斗草对CCl4所致肝损伤小鼠血清T-BIL、D-BIL、ALT和AST的影响 与空白组比较，模型组血清 T-BIL显著增加(P＜0.05)，D-BIL、ALT、AST亦显著增加(P＜0.01)，说明急性肝损伤模型造模成功。与CCl4模型组比较，复方风柜斗草中、高剂量组、联苯双酯组小鼠血清 T-BIL、D-BIL、ALT、AST明显降低(P＜0.05或0.01)。见表1。

3.2 复方风柜斗草对CCl4所致肝损伤小鼠肝组织中MDA含量及SOD活性的影响 CCl4模型组与空白组比较，肝组织中MDA含量升高(P＜0.01)，SOD活性降低(P＜0.05)。与CCl4模型组比较，复方风柜斗草中、高剂量组、联苯双酯组可降低肝损伤小鼠肝组织中MDA含量，提高SOD活性(P＜0.05或0.01)。见表2。

表1 复方风柜斗草对小鼠急性肝损伤肝血清T-BIL、D-BIL、ALT和AST的影响(±s)

表1 复方风柜斗草对小鼠急性肝损伤肝血清T-BIL、D-BIL、ALT和AST的影响(±s)

注:与空白组比较，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 n 剂量(g/kg) T-BIL(μmol/L)D-BIL(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)空白组 10 － 1.16±0.28 0.55±0.14 34.75±3.56 94.73±19.17 CCl4模型组 10 － 1.67 ±0.58* 0.81±0.21＊＊ 88.72±39.25＊＊ 166.49 ±49.37＊＊低剂量组 10 2.2 1.34 ±0.36* 0.67 ±0.15＊＊ 60.83 ±32.76* 137.14 ±35.39*中剂量组 10 4.4 1.21 ±0.21* 0.57 ±0.12＊＊ 53.22 ±20.61* 125.10 ±30.75*高剂量组 10 8.8 1.21 ±0.32* 0.53 ±0.18＊＊ 46.98 ±15.27* 121.14 ±27.18*联苯双酯组 10 0.2 0.91 ±0.12＊＊ 0.48 ±0.13＊＊ 44.38 ±25.50＊＊ 123.97 ±30.40*

表2 复方风柜斗草对小鼠急性肝损伤肝组织中MDA水平及SOD活性影响(±s)

表2 复方风柜斗草对小鼠急性肝损伤肝组织中MDA水平及SOD活性影响(±s)

注:与空白组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与 CCl4模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

组别 n 剂量(g/kg)MDA(nmol/mL)SOD(U/mg)空白组10 － 51.82 ±16.15 159.79 ±76.99 CCl4模型组 10 － 85.38±22.94 ＊＊ 92.08±54.02*低剂量组 10 2.2 68.53 ±13.62▲ 148.17 ±58.62▲中剂量组 10 4.4 60.56 ±12.04▲▲ 150.06 ±67.49▲高剂量组 10 8.8 56.92 ±10.13▲▲ 177.98 ±53.46▲▲联苯双酯组 10 0.2 68.32±17.49▲ 175.71±84.79▲

3.3 复方风柜斗草对小鼠体重及肝脏指数的影响在10 d的给药期间内，高剂量组小鼠的体重增加最多，均值达到28.93 g，其次为联苯双酯组，见表3。复方风柜斗草对CCl4所致肝损伤小鼠肝脏指数的影响，各组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05);但与空白组比较，各组小鼠的肝脏均有不同程度的肿胀，各给药组均不能降低CCl4所致急性肝肿胀。

表3 复方风柜斗草对小鼠体重及肝脏指数的影响

4 讨论

肝脏氧化损伤可引发多种疾病或加重机体的病变。CCl4是一种经典的诱发急性肝损伤的肝毒性药物，选用0.1%CCl4大豆油作为造模材料，可以得到肝损伤程度合理、统计结果误差较小的CCl4小鼠急性肝损伤模型［5-7］。本实验采用0.1%CCl4大豆油(0.1 mL/10 g体重)灌胃，与空白对照组比较，模型组血清T-BIL、D-BIL、ALT、AST水平均显著增加，说明急性肝损伤造模成功。

CCl4进入体内，经肝微粒体细胞色素P450作用下代谢为CCl3，并攻击肝细胞膜上的磷脂分子，引起膜的脂质过氧化反应以及直接的膜溶解作用，导致肝细胞变性坏死或肝细胞通透性增强，进而引起血清中的 ALT、AST、T-BID、D-BID 含量上升［8-9］。SOD是体内清除自由基、抑制自由基反应的物质基础之一，其活性降低则会导致体内氧自由基积累，引发质膜的过氧化作用，使膜结构破坏与功能受到损伤。MDA是氧自由基攻击生物膜结构中的多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应生成的，是脂质过氧化反应的最终产物［10-11］。小鼠腹腔注射CCl4导致急性肝损伤时，过量的氧自由基产生于肝组织细胞可引起SOD水平下降及MDA含量升高，通过检测小鼠肝匀浆中的SOD活性及MDA含量可间接反映出药物对肝细胞的保护作用［12-13］。

本实验显示，复方风柜斗草醇提物的高、中剂量组与联苯双酯对照组可显著降低CCl4引起急性肝损害小鼠血清中的ALT、AST、T-BIL、D-BIL的含量，并提高肝匀浆组织中的 SOD活性，降低组织中MDA含量，且复方风柜斗草高剂量组各项指标与联苯双酯对照组接近。在小鼠体重方面，高剂量组体重均数比空白组增加2.53 g，其次为联苯双酯组增加1.91 g，说明复方风柜斗草对提高小鼠体质量具有一定的作用。与模型组比较，各给药组小鼠在肝脏指数方面并未见降低，说明各给药组小鼠不能降低由于CCl4引起的肝脏肿胀，其原因可能是CCl4引起损伤的早期，肝小叶结构被破坏，肝细胞不同程度肿胀未能及时修复而导致肝脏指数的增加。

综上所述，复方风柜斗草具有保肝和对抗CCl4引起急性肝损伤的作用，其机制可能与复方风柜斗草所具有抗脂质过氧化和清除体内过多的氧自由基的作用有关，本研究为临床应用复方风柜斗草治疗急性肝损伤提供了理论参考。

［1］ 陈美惠，刘文雅，李 黎.复方风柜斗草提取工艺的研究［J］.东南国防医药，2014，16(4):414-415，426.

［2］ 廖 梅，张锦文，张勇慧.楮头红保肝护肝活性部位筛选［J］.医药导报，2010，29(5):571-572.

［3］ 宋立人，洪 恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典上册［M］.北京:人民卫生出版社，2001:867.

［4］ 杨 云，胡筱希，周凌凌，等.龙葵多糖对CCl4致急性肝损伤小鼠的保护作用研究［J］.中成药，2014，36(12):2602-2605.

［5］ Chang ML，Yeh CT，Chang PY，et al.Comparison of murine cirrhosis models induced by hepatotoxin administration and common bile duct ligation［J］.World J Gastroenterol，2005，11(27):4167-4172.

［6］ 黎 旸，李瑾翡，蒋忠军，等.CCl4致小鼠急性肝损伤模型的研究［J］.热带医学杂志，2010，10(6):657-659.

［7］ 丁体龙，马 勇，严家春，等.“抗纤汤”治疗四氯化碳致肝纤维化大鼠模型的实验研究［J］.东南国防医药，2004，6(3):175-176.

［8］ 王 欣，熊 哲.黄芩素对急性肝损伤模型小鼠的保护作用及其机制［J］.医药导报，2012，31(8):1000-1002.

［9］ Boll M，Weber LW，Becker E，et al.Mechanism of carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity.Hepatocellular damage by reactive carbon tetrachloride metabolites［J］.Z Naturforsch，2001，56(7-8):649-659.

［10］夏西超，华春秀，姜 晓，等.和厚朴酚对急性肝损伤模型小鼠抗氧化作用研究［J］.时珍国医国药，2013，24(2):361-362.

［11］ Wang L，Albrecht MA，Wurtman RJ.Dietary supplementation with uridine-5’-monophosphate(UMP)，amembrane phosphatide precursor，increases acetylcholine level and release in striatum of aged rat［J］.Brain Res，2007，1133(1):42-48.

［12］杨珊珊，慎爱民，丁立新，等.毛蕊花苷固体脂质纳米粒的制备及对小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.中国医院药学杂志，2014，34(1):4-8.

［13］戴城烽，李 娟，金璐燕.姜黄素-3脂质体对小鼠四氯化碳急性肝损伤的保护作用及其机制［J］.中国临床药理学与治疗学，2008，13(4):401-405.