3种医院外用口腔膜剂的微生物限度检查方法研究

张心悦，武海萍，朱逍遥，侯晶晶，卜 莹

复方维A酸膜、复方硫酸庆大霉素膜和甲硝唑膜是《中国人民解放军医疗机构制剂规范》(2002)版［1］收载的医院常用外用口腔制剂。其中，复方维A酸膜无抑菌性，有促进表皮细胞增生分化作用，用于口腔白斑及扁平苔藓等治疗［2］;复方硫酸庆大霉素膜有抑菌性，能够消炎、止痛，促进黏膜创面，多用于口腔溃疡治疗;甲硝唑膜是抗厌氧菌药膜，用于治疗厌氧菌感染引起的牙周炎等口腔炎症［3］。经过文献查新，目前尚未见这3种制剂微生物限度检查方法的报道，为有效控制医院制剂质量，本文按《中国药典》2010年版二部［4］规定进行微生物限度方法学验证，并建立了这3种医院外用口腔膜剂的微生物限度检查方法。

1 试药与仪器

1.1 供试品 复方维A酸膜(第四军医大学提供，批号:130801、130811、130820);复方硫酸庆大霉素膜(第四军医大学提供，批号:130814、130819、130803);甲硝唑膜(第四军医大学提供，批号:20131016、20130824、20131102)。

1.2 仪器设备 JY10001电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);HP型电热恒温培养箱(沈阳利港净化设备有限公司);SP-150A生化培养箱(南京恒裕仪器设备制造有限公司);SPX-150B-Z生化培养箱(上海博讯实业有限公司);SX-500高压蒸汽灭菌器(日本Tomy Digital Biology公司);HH2数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);HTY-300微生物过滤支架、一次性无菌过滤器(杭州泰林生物技术设备有限公司)等。

1.3 验证菌株 金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］;白色念珠菌［CMCC(F)98001］;枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］;黑曲霉菌［CMCC(F)98003］;大肠埃希菌［CMCC(B)44102］;铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］，均由中国食品药品检定研究院提供，传代次数均不超过5代。

1.4 培养基和稀释剂 营养琼脂培养基(批号:121226);玫瑰红钠琼脂培养基(批号:130105);改良马丁琼脂培养基(批号:121123);改良马丁培养基(批号:130118);营养肉汤培养基(批号:121213);胆盐乳糖培养基(批号:130106);甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号:121030);溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号:1109282);pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号:130426)，均由北京三药科技开发公司生产。

2 验证方法

2.1 菌液制备 取35℃培养24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌的肉汤培养物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化钠溶液中，稀释制成含菌数为50～100 cfu/mL的菌悬液。取25℃培养48 h的白色念珠菌液体培养物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化钠溶液中，稀释制成含酵母菌数为50～100 cfu/mL的菌悬液。取25℃培养1周的黑曲霉真菌斜面培养物，用5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，并稀释制成为50～100 cfu/mL的孢子液。

2.2 供试液制备 取供试品各100 cm2，加45℃pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，浸泡、振摇，使充分分散均匀，作为1∶10供试液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数验证［5］

2.3.1 试验组 常规法:复方维A酸膜，无抑菌性可采用常规法。取1 mL 1∶10供试液和1 mL含菌数为50～100 cfu/mL的菌液注入一个平皿中，培养基浇碟、培养。每个试验菌株制备2个平皿，培养完毕后计菌落数，取平均值。薄膜过滤法:复方硫酸庆大霉素膜［6］，取 10 mL 1∶10 供试液薄膜过滤，冲洗液选择0.1%无菌蛋白胨水溶液300 mL、600 mL和1000 mL三个梯度冲洗，在最后一次冲洗液中加入1 mL含菌数为50～100 cfu/mL的菌液，摇匀过滤，取膜贴于琼脂培养基，培养，计数。甲硝唑膜［7］，取10 mL 1∶10供试液薄膜过滤，冲洗液选择pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100 mL、300 mL和500 mL三个梯度冲洗，在最后一次冲洗液中加入1 mL含菌数为50～100 cfu/mL的菌液，摇匀过滤，取膜贴于琼脂培养基，培养，计数。

2.3.2 菌液组 取与试验组中相同稀释浓度的各株菌悬液1 mL，测定其菌落数。每个菌株平行制备2个平皿，计算平均菌落数。

2.3.3 供试液对照组 取与试验组同一供试品溶液，按2.3.1方法，不加菌液，测定供试液本底菌落数。

2.3.4 稀释剂对照组 取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按2.3.1方法测定菌落数。

2.3.5 计算公式 试验组菌落数回收率(%)=(试验组平均菌落数－供试液对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%，稀释剂对照组菌数回收率(%)=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%

2.4 验证菌检查法

2.4.1 试验组 常规法 复方维 A酸膜，取10 mL 1∶10供试液和1 mL含菌数为50～100 cfu/mL的菌液加至100 mL培养基中培养。薄膜过滤法:复方庆大霉素膜和维A酸膜博膜过滤冲洗方法同2.3.1。

2.4.2 阴性对照组 取pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液代替供试液，按2.4.1方法操作。

3 结果

3.1 细菌、霉菌及酵母菌计数 分别测定3种供试品的回收率，进行3次平行试验，稀释剂对照组回收率均高于70%。由表1可知，复方维A酸膜无抑菌作用，可采用常规法检查;复方硫酸庆大霉素膜对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌有较强的抑制作用，采用薄膜过滤法，0.1%无菌蛋白胨缓冲液冲洗(1000 mL/膜)各验证菌回收率能达到70%以上;甲硝唑膜为抗厌氧菌制剂，采用薄膜过滤法，pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗(500 mL/膜)，各验证菌回收率能达到70%以上。

3.2 验证菌检查 由表2可知，复方维A酸膜可采用常规法检查验证菌，复方庆大霉素膜和甲硝唑膜由于抑菌的作用较强，只能采用薄膜过滤法检查，冲洗液与冲洗量与细菌、霉菌及酵母菌计数相同。

表1 细菌、霉菌及酵母菌的验证回收率(%，n=3)

表2 验证菌检查方法的验证结果

4 讨论

膜剂是药物与适宜的成膜材料经加工制成的膜状制剂［8］。复方维A酸膜、复方庆大霉素膜和甲硝唑膜所使用的成膜材料均为聚乙烯醇17-88，都是水溶性膜［9］，可直接用45℃ pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液溶解。

甲硝唑膜对厌氧菌有较强的抑菌作用，采用梯度设置冲洗液冲洗量，当冲洗剂的冲洗量达到500 mL/膜时，验证菌株的回收率能达到70%。复方庆大霉素膜使用薄膜过滤冲洗时，pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液的冲洗量达到1000 mL/膜仍无法消除其抑菌性，改用0.1%蛋白胨缓冲液，冲洗量达到1000 mL/膜后，验证菌株的回收率能达到70%。

［1］ 人民军医出版社.中国人民解放军医疗机构制剂规范(2002年版)［M］.北京:人民军医出版社，2003:2.

［2］ 钟 燕，孙永瀛.维A酸联合塞来昔布治疗口腔白斑的临床研究［J］.中国临床研究，2015，28(2):230-232.

［3］ 杨再永.我军陆军口腔健康和卫生勤务保障现状及对策［J］.东南国防医药，2013，15(6):612-614.

［4］ 中国医药科技出版社.中华人民共和国药典(2010年版)二部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:1.

［5］ 杨宗学，陈 丽，姚 青，等.复方地恩酚软膏的微生物方法验证［J］.东南国防医药，2011，13(4):302-304.

［6］ 刘 英，王立萍.庆大霉素组分和有关物质对效价的影响［J］.中国抗生素杂志，2012，37(2):127-131.

［7］ 余晓霞，邱凯锋，刘春霞.新唑漱口液微生物限度检查方法的验证［J］.海峡药学，2014，26(10):51-53.

［8］ 邱小玲，林 绥，阙慧卿.涂膜剂的研究概述［J］.海峡药学，2009，21(8):16-18.

［9］ 郑健鸿，林燕月.治疗溃疡膜材料和载药膜材料的检测指标［J］.中国组织工程研究，2013，17(3):536-543.