肿瘤坏死因子受体选择性拮抗剂的研究进展

江海龙，王宁远，2，陆一鸣（．第二军医大学药学院微生物与生化药学教研室，上海200433；2．福建中医药大学药学院，福建福州35008）

肿瘤坏死因子受体选择性拮抗剂的研究进展

江海龙1，王宁远1，2，陆一鸣1（1．第二军医大学药学院微生物与生化药学教研室，上海200433；2．福建中医药大学药学院，福建福州350108）

肿瘤坏死因子（TNF）信号通路是很有价值的治疗靶标，抗TNF药物已成功治疗自身免疫和炎症疾病，但传统的抗TNF药物完全封闭TNF信号通路，导致影响自身的免疫调节和监视功能而增加感染、致癌的风险和产生新的自身免疫疾病。选择性抑制sTNF／TNFR1而保留m TNF／TNFR2传导的信号能减少副作用而不降低治疗效果。该文探讨了选择性抑制TNFR1介导的信号通路对治疗TNF相关疾病的意义，分析TNF识别并激活肿瘤坏死因子受体（TNFR）的作用机制，可能会为设计新药提供新的思路。

肿瘤坏死因子受体；选择性拮抗；药物靶点

TNF不仅帮助机体抵御感染，而且能抑制自身免疫疾病的发展和肿瘤形成。然而，全身和局部的TNF过度表达会诱导相关基因参与慢性或急性炎症反应而产生不良反应。比如，在小鼠关节、肠道、中央神经系统选择性过度表达人TNF将分别导致炎症性关节炎、炎症性肠病、脱髓鞘等［1］。过去十年，几百万患者使用了抗TNF抗体治疗取得很好的治疗效果，这也证实非感染性炎症和自身免疫介导的疾病机制同TNF功能有密切联系［2］。

近期研究发现，TNF表达下调会诱发一些疾病，长期使用TNF拮抗剂也带来不少副作用。TNF信号是有益还是有害取决于不同的配体（m TNF、sTNF）和受体（TNFR1、TNFR2）之间的相互作用。保留膜型TNF、TNFR2不被抑制或使用TNFR2激动剂，以及完全抑制可溶性TNF和膜型TNFR1能减少TNF完全拮抗剂带来的副作用。因此了解TNF结合TNFR1、TNFR2的分子机制，分析TNFR介导的信号通路中存在的新靶点及其相关药物，将有助于实现对疾病更为彻底的治疗，降低副作用的发生。

1 TNFR1、TNFR2介导的信号通路

单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞是TNF的主要来源，主要以2种不同的形式存在：分布于细胞膜表面的蛋白分子（m TNF）和酶降解后可溶性的蛋白肽（sTNF）。膜型和可溶性的TNF分别与2种同源的膜受体相互作用，即表达于大多数细胞表面的TNFR1和优先表达于造血细胞的TNFR2。虽然两种受体都可和两种形式的TNF结合，但可溶性的TNF多和TNFR1结合，膜型的TNF易结合TNFR2。TNFR1传递的信号与促进炎症、细胞毒性、细胞凋亡相关，而TNFR2传导的信号与促进细胞活化、增殖、迁移有关［3］。

膜结合的TNF、TNFR被金属蛋白酶TACE（TNF转化酶）剪切成可溶性的蛋白。TACE作用于m TNF的66位A la和67位Val形成相对分子质量为17 483的sTNF。近期，M cllwain等［4］发现菱形蛋白家族的iRhom2能调节造血细胞中TACE的成熟和运输，iRhom2基因敲除的小鼠给以致死剂量的LPS仍能存活，这可能使iRhom2成为治疗TNF相关疾病的一个新靶标。

三聚化的TNF和TNFR1的胞外区结合将诱导产生两种复合物，第一种复合物通过TNFR1-TRADD-TRAF途径激活MAPK和NF-κB通路控制促炎分子与抗凋亡蛋白的表达，第二种复合物通过TNFR1-TRADD-FADD途径促进凋亡过程。TNFR2胞内域虽然没有DD结构域，但是可与TNF受体相关因子（TRAF）的基序结合后激活NF-κB和JNK激酶。磷酸化的TRAF2能激活NF-κB和JNK，但也能抑制JNK的持续激活。在两种受体共激活和表达时，TNFR2诱导TRAF2的降解将抑制抗凋亡通路和促进TNFR1介导的细胞毒性。TNFR2与膜型TNF的结合能力强于可溶性的TNF，它将可溶性的TNF传递给TNFR1，增强其信号传导。TNFR2广泛表达于Treg细胞表面，Treg对维持自身抗原耐受有很重要的作用，完全封闭TNF将导致Treg功能的异常，诱导自身免疫疾病的出现。Chen等［5］发现TNFR2能稳定CD4＋Foxp3＋Treg，使其维持免疫自稳、避免自身免疫异常和肿瘤的免疫侵袭。TNFR2介导的信号通路在关节炎和部分炎症疾病中有保护作用，有文献报道选择性激动TNFR2能破坏CD8T细胞，有效治疗1型糖尿病［6］。保留m TNF而抑制sTNF能够维持机体抵抗病原体的能力，激活后续通路产生的NO也维持其抗肿瘤效应。

2 TNF与其受体的相互作用

TNF是Ⅱ型跨膜蛋白（单次跨膜，C端在胞外，N端在胞浆内），C端胞外区的150个氨基酸残基组成TNF同源区（THD），结构上为10个β条带构成的β凝胶卷。为了同TNFR作用，THD常以β面用非共价键形式聚集成同源三聚体。

TNF受体为Ⅰ型跨膜受体（单次跨膜，N端在胞外），有4个富含半胱氨酸区域（CRD1～4），CRD2和CRD3结合TNF，CRD1（又称前配体装配区，pre-ligand assembly domain，PLAD）帮助TNFR1、TNFR2的同源三聚化。TNF和TNFR以3∶3比例形成复合物是信号传递的前提，而TNFR通过CRD1在细胞表面预装成二聚体。可溶性的PLAD可选择性的抑制相应TNFR的同源三聚化，阻断TNF介导的炎症信号。CRD2结构上高度保守，负责调节结合的紧密程度；CRD3结构上高度可变，负责调节结合的特异性［7］。

两种TNFR都是以复合物的形式发挥作用的，而不是通过单独的受体亚单元与配体的寡聚作用。Yohei等［2］用实验证实了TNFR2形成复合物对信号起始的重要性。在分析TNF与受体晶体复合物时发现，TNFR2的接触面比TNFR1带更多的负电荷。两种受体在结合区域存在分子对接口袋（TNFR2：Ser79to Asp81，TNFR1：A rg77to Gly81），这些位点的基序可被用来设计选择性受体拮抗剂。

3 传统的抗TNF抗体及其缺点

目前上市的抗TNF抗体有：①人鼠嵌合的单抗：英夫利昔单抗（infliximab）；②完全人化的抗体：阿达木单抗（adalibumab）；③可溶性TNFRⅡ型受体与IgG分子Fc区的融合蛋白：依那西普（etanercept）。使用英夫利昔和阿达木单抗治疗风湿性关节炎的患者容易出现结核杆菌及真菌恶性感染等不良反应［8］。依那西普结合m TNF的能力较弱，治疗克罗恩病的疗效逊于英夫利昔单抗和阿达木单抗，但它不容易引起感染。这表明较弱的m TNF结合能力有助于免疫系统更好地发挥作用［9］。

4 当前非抗体蛋白对TNFR的作用

4．1颗粒蛋白前体（progranulin） 颗粒蛋白前体大量表达于内皮细胞、免疫细胞、神经元细胞、软骨细胞，是一种内源性生长因子，常与主动防御、炎症、肿瘤、神经功能有关。沉默颗粒蛋白前体将加重胶原诱导的小鼠关节炎模型的疾病症状。重新给以人重组颗粒蛋白前体，能阻止疾病的进展。相似的结果在TNF转基因小鼠关节炎模型有报道，表明颗粒蛋白前体通过抑制体内TNF／TNFR信号实现它的抗炎效应。唐伟等［10］使用酵母双杂交筛选，确定了TNFR1和TNFR2是这种分子主要的结合蛋白。他们开发了一种类似的小分子atsttrin，保留了progranulin作用于TNFR的基本功能，对TNFR2的亲和力高于TNFR1。atsttrin在延缓疾病进展上比progranulin效果更好，比依那西普更能减轻关节炎动物模型的炎症。progranulin／atsttrin的作用机制可能是多方面的，它一方面作为拮抗剂抑制TNFR1介导的炎症信号通路，另一方面作为激动剂促进TNFR2介导的Treg和Teff调节功能。

4．2肿瘤坏死因子受体的前配体装配区 前配体装配区（PLAD）是TNFR在细胞外氨基末端的区域，它在物理性质上与几种TNF接触的主要区域不同，预示着它在TNFR信号转导中有很重要的作用。Deng等［11］发现可溶性的PLAD（尤其是TNFR1来源的）可拮抗TNF在体外的生化效应和显著抑制动物关节炎模型的炎症。可能是膜型TNF产生的有益信号被抑制，而可溶性TNF产生的有害信号未被封闭。

4．3胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP-5） 胰岛素样生长因子结合蛋白是胰岛素样生长因子（IGF）系统的重要成员，它可以和IGFs结合形成复合物，使得血液中能与IGF受体结合的IGFs减少，降低其促增殖、分化、能量代谢等作用。IGFBP-5有3段功能域：N末端功能域、L功能域、C末端功能域。Hwang等［12］通过免疫共沉淀发现，只有IGFBP-5的L段能够选择性地与TNFR1结合，竞争抑制TNF结合TNFR1，从而抑制下游的促炎效应。

4．4TNF突变体 Mukai等［13］利用噬菌体展示技术使TNF在29-32、84-89、145-147等位点的氨基酸产生突变，筛选出高亲和性的TNF突变体R1antTNF。R1antTNF对TNFR1的结合能力强于野生型TNF，而结合TNFR2的能力下降，体内外实验都证明其具有很好的抗炎效应。

4．5基于TNFR1的模拟肽 Takasaki等［14］通过研究TNF与其受体的晶体结构，确定了关键的TNF结合位点。将这些位点的氨基酸序列进行替换和环化，发现其中的WP9QY具有很好的TNFR1结合活性。在TNF介导的细胞毒效应中，75μmol／L的WP9QY可缓解90%的L929细胞不被杀死。M ukaro［15］利用放射性碘标记TNF70-80多肽（该多肽只激活p38和NF-κB）和相应的TNF突变体，发现了TNF70-80多肽的结合位点（位于TNFR1胞外区和跨膜区的三肽GTT），并合成一段重复的九肽（GTTGTTGTT），取得良好的抗TNF效应。

4．6 从固相合成随机肽库中筛选活性肽 Chidnos-Rojas等［16］利用固相合成组合随机肽库鉴定了两条多肽，SEP1（SSYKYLXX）、SEP7（PIRRSDSX）可模仿TNF受体结合位点的功能。细胞毒性实验表明，该多肽以剂量依赖性方式抑制TNF杀伤人KYM-ID4细胞和小鼠L929细胞。分析表明，该抑制作用依赖于精氨酸侧链上的咪唑基。

4．7从噬菌体展示文库中淘选封闭肽 尹丙姣等［17，18］以TNFR1为靶点采用噬菌体展示技术进行亲和淘选12线肽库和环9肽库，获取了具有较好结合能力和生物活性的多肽（12线肽：DHRPLWGESMVW、环9肽：CKHALHRHC）。用人IgG1的Fc段连接多肽获得的融合蛋白具有更好的结合能力和活性，显著抑制人单核细胞炎症因子的释放，可抵抗高脂血症诱导的小鼠肥胖。

5 TNFR1选择性抗体

科研工作者长期致力于获得选择性拮抗TNFR1的单抗，但未获得理想的效果。因为多数TNFR1单抗不是以拮抗剂的方式识别TNF的结合位点，而是以激动剂的方式起作用。Roland等［19］第一次获得了人源化的TNFR1抗体（IZI-06．1），与TNFR1的半胱氨酸富含区1（CRD1）有很高的亲和性，而对TNFR2无亲和作用。IZI-06.1抑制凋亡的同时也抑制炎症因子的表达。TNFR1抗体能治疗TNF抗体治疗效果不佳的疾病，减少TNF抗体所致的副作用，目前已进入Ⅱ期临床研究阶段。

6 小分子TNFR1拮抗剂

Carter等［20］通过筛选化合物库显示母核结构为N-烷基-5-芳香基-2-呋喃-1，3-噻唑-4-酮的化合物能够破坏TNF结合TNFR1（IC50＝50 nmol／L），从而抑制Ramos细胞中IκB磷酸化（IC50＝600 nmol／L）。这类化合物与TNFR1有较弱的结合能力（40～100μmol），在光的作用下与TNFR1上A la-62的N原子发生共价结合。M urali等［21］通过设计小分子化合物（F002）与TNFR的W-107结合，使TNFR1产生变构效应，占据了TNF与TNFR1的结合位点，使下游的炎症激活通路得到抑制。虽然发现多种小分子天然化合物可以在细胞水平抑制TNF的活性，但是大多数小分子化合物体内起效浓度很高，而且还有较强的细胞毒性。

7 总结

过去20年，抗TNF治疗取得很好的效果，使用TNF抗体甚至成为关节炎和炎性肠病的标准治疗方式。TNF作为多功能的细胞因子，完全拮抗TNF的所有信号通路会产生严重的副作用。选择性抑制TNFR1和sTNF，或激动TNFR2能避免抑制炎症通路的同时而不影响免疫调节和监视功能。目前文献报道的方法有：①设计针对iRhom2的药物影响TACE表达或筛选药物直接抑制TACE的活性来调节可溶性TNF浓度；②利用TNFR1、TNFR2与TNF结合的晶体结构分析存在的分子对接口袋，设计选择性结合TNFR1的小分子药物；③改造内源性的配体（颗粒蛋白前体、胰岛素样生长因子结合蛋白5、TNFR1的PLAD）以增强其结合的选择性；④利用文库淘选结合TNFR1的单抗等等。TNFR2有维持免疫自稳的作用，但其具体机制还不明确，使用TNFR2激动剂能改善一些炎症疾病，但还不清楚其促增殖作用是否会增加癌变风险。已报道的几种靶向TNFR1的小分子药物虽然有较好的拮抗作用，但也带来明显的细胞毒性。因此综合考量以上因素，选择合适的药物抑制TNF的部分通路，将是未来研究抗TNF药物的主要方向。

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Research advance of selective inhibitor of tumornecrosis factor receptor

JIANG Hailong1，WANG Ningyuan1，2，LU Yiming1（1．Department of M icrobial and Biochemical Pharmacy，Schoolof Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China；2．FuJian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，China）

TNF signaling pathway was a valuable target，and anti-TNF drugs were successfully used to treat autoimmune and inflammatory diseases．But this therapy abrogate some beneficial TNF signaling，leading to increased risk of infection and malignancy，and the onset of new auto-immune diseases．Inhibiting the soluble TNF／TNFR1 axiswhile saving the beneficial transmembrane TNF／TNFR2 signaling untouched was a new approach．Because it inhibited the pathologicaleffects of TNF and reduced the side effects，and opened theway for the treatment of other diseases in which TNFR2 inhibition was detrimental．The significance of the selective inhibition of TNFR 1-mediated signaling pathways for TNF-related diseases was discussed and themechanism of TNF identification TNFR was clarified，whichmight provide new ideas for the design of new drugs．

TNFR；selective inhibition；drug target

R979．1

A

1006-0111（2015）05-0392-04

10．3969／j．issn．1006-0111．2015．05．003

2014-04-18

2014-11-03

［本文编辑］ 顾文华

国家自然科学基金（30500093）；国家科技部“重大新药创制”专项（2009ZX09103-690）；上海市科委重点项目（04JC14002）；军队“十一五”计划（06Q042）；上海市高校优秀青年教师科研专项基金（ejd09011）

江海龙，硕士研究生，E-mail：136396583＠qq．com

陆一鸣，博士，副教授．研究方向：小肽类药物．E-mail：bluesluyi＠163．com