济渎红蒜茎尖脱毒快繁培养技术研究

陈丽，赵玉玲，张庆社，田瑞昌，陈坤，葛佳文，牛小沛，马朝喜

（河南济源市农业科学院，459000）

大蒜作为一种特殊蔬菜，不仅含有丰富的维生素、氨基酸、矿质元素等营养成分，而且含有特殊的抗菌、抗癌等活性物质，被认为是重要的天然保健品[1，2]。济渎红蒜是济源市地方特色品种，味道辛辣鲜美、蒜薹短粗肥嫩无梗丝、蒜泥味道长久，其独特的品质深受济源人喜爱。济渎红蒜蒜皮紫红透明、光泽喜人，在清朝时作为贡品，只有皇族才能享用，因此又被称为“济渎金蒜”。近年来，由于病毒病的为害，我国大蒜种性普遍退化、单产降低、品质变劣，一些名优特种大蒜因受病毒病为害几乎濒于绝种[3，4]。本试验以济渎红蒜为材料，以期筛选出适合其脱毒快繁的培养基，建立一套适宜济源市名优大蒜地方品种脱毒快繁的技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

济渎红蒜，由济源市农科院种植培育。

1.2 试验方法

①剥离茎尖时间的筛选 2014年5月底收获济渎红蒜，从收获初开始，每月进行1～2次茎尖剥离试验。

②外植体处理 选择生长良好的济渎红蒜流水冲洗5 h，用洗洁精冲洗数次后，用手术刀片切除2/3留基部备用。无菌操作下75%酒精消毒35 s→无菌水冲洗1次→0.1%氯化汞灭菌10 min→无菌水冲洗8次进行材料表面灭菌。然后用无菌滤纸吸干水分，在显微镜下剥离茎尖，茎尖长度为0.2～0.6 mm，以备接种。

③愈伤组织诱导培养基配方的筛选 以1/2 MS培养基为基础培养基，设6-BA、2，4-D、NAA 3个因素，每个因素3个水平，详见表1，共9个处理，详见表2，每处理3次重复。培养基pH值6.0、蔗糖浓度为30%、琼脂粉含量3 g/L。将剥离好的茎尖接种在不同培养基上，散射光光照强度2 000～3 000 lx、温度（25±2）℃、光照时间 12 h/d进行培养。

④分化增殖培养基的筛选 以1/2 MS培养基为基础培养基，加入不同浓度的 6-BA、NAA、2，4-D，共6个处理，详见表3，每处理4次重复；培养基pH值6.0、蔗糖浓度30%、琼脂粉含量3 g/L。将诱导的愈伤组织接种在不同培养基上，培养条件同③。

⑤生根培养基的筛选和移栽 以1/2 MS培养基为基础培养基，加入不同浓度6-BA、NAA，详见表4，共4个处理；将增殖济渎红蒜苗接种于生根培养基上，观察生根情况；培养条件同③。将生根后的脱毒苗，移栽到已灭菌的草炭∶蛭石=2∶1的穴盘中。移栽后覆盖遮阳网防晒、防虫网防蚜虫。

⑥大蒜内病毒的检测 将剥离的大蒜茎尖培养2个月后，取部分愈伤或小苗捣碎、研磨，制成组织汁液，用磷酸盐缓冲液在3 000 r/min离心20 min后，在电镜下观察，并以未脱毒的样品作对照，确认含病毒的基本形态和特征。

2 结果与分析

2.1 不同时间对济渎红蒜茎尖剥离的影响

根据每月剥离的情况发现，每年的5月底到翌年2月底，茎尖容易剥离，并且8～10月剥离的茎尖诱导成活率高于其他时间。因为初期剥离的茎尖，茎尖含水量大，剥离过程中易破碎；而后期，茎尖较小，不易剥离。

表1 试验设计 mg/L

表2 济渎红蒜愈伤组织诱导培养基的筛选

表3 济渎红蒜分化增殖培养基的筛选

2.2 济渎红蒜愈伤组织诱导培养基的筛选

为了促进茎尖成活以及分化，需选择合适的激素配比。试验观察发现，如果在接种后14 d，茎尖出现透明状，说明在诱导愈伤过程中出现玻璃化现象，且培养基湿度大；接种20 d后，茎尖泛绿色，并且膨大，说明开始诱导愈伤。正常的愈伤组织是黄绿色，且结构较为紧密，这种愈伤组织分生能力强，芽点较多；若为深绿色，则太硬不易分化，且最后容易转变为浅黄色而死亡。由表2可知，1/2 MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.8 mg/L的培养基愈伤组织诱导率较高，但愈伤组织呈浅黄色，不分化、不成块，在培养过程中逐渐玻璃化死亡。因此，最佳的诱导培养基为1/2 MS+6-BA 1.8 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.6 mg/L。

2.3 济渎红蒜分化增殖培养基的筛选

选择较好的愈伤组织进行分化增殖培养，在激素浓度较高的条件下，诱导增殖率会降低，主要表现为形成畸形苗、叶片较长，芽尖生长较慢；有些会出现芽点较多、较绿，而分化比较少的情况。从表3可以看出，1/2 MS+6-BA 2.6 mg/L+2，4－D 0.3 mg/L+NAA 1.5 mg/L，增殖系数可达4倍，出苗比较整齐，分化苗生长比较健壮。

表4 济渎红蒜愈伤组织的继代培养情况

2.4 济渎红蒜生根培养基的筛选

从表4可以看出，1/2 MS+6-BA 2.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L，生根效果最好。6-BA浓度为2.2 mg/L的培养基中，生根少且较慢，出现根部膨大的现象，影响移栽成活率。

2.5 病毒检测结果

随机取再生大蒜幼苗50株，用未经脱毒的大蒜幼苗作对照，进行检测。结果发现，对照100%含病毒，且病毒含量很高；而再生的大蒜幼苗有68%不含病毒，即脱去病毒；15%的病毒含量高，但仍低于对照。说明茎尖剥离脱毒可降低病毒含量。

3 讨论与结论

有资料显示，切取蒜瓣内幼芽的茎尖分生组织，经组织培养获得脱毒苗是解决大蒜品种退化、提高大蒜产量和质量的有效途径[5～7]。茎尖剥离过程中，其大小直接影响脱毒效果及成活率。试验中发现，0.3～0.5 mm长的茎尖有利于提高成活率并且脱毒效果比较明显；虽然0.1～0.2 mm的茎尖脱毒效果最好，但是接种后成活率不高；而茎尖长度低于0.4 mm时，诱导愈伤时玻璃化现象严重，原因有待进一步分析。但在脱毒过程中，完全脱毒的成功率还不是很高，下一步需要改进脱毒方法。

[1]管正学，王建立，张学予.我国大蒜资源及其开发利用研究[J].自然资源，1994（5）：54-59.

[2]廉洁燮，金今松，马英金，等.大蒜的应用价值及其产品[J].延边农学院学报，1990（4）：74-80.

[3]张寒霜.大蒜茎尖脱毒培养及快繁技术研究[J].华北农学报，2006，21（B11）：117-119.

[4]栾非时.脱毒大蒜花原始体培养增殖技术的研究[J].中国蔬菜，1995（3）：4-6.

[5]高山林，金雍安，蔡朝晖.大蒜分生组织培养脱病毒和快速繁殖技术[J].植物资源与环境学报，2000，9（3）：15-18.

[6]郑晓峰，黄刚.麻江红蒜茎尖组织培养及快繁技术研究[J].长江蔬菜，2008（24）：16-17.

[7]刘德军.大蒜——药用动植物种养加工[M].北京：中国中医药出版社，2001：55-56.