以PHBⅤ为固相碳源同时去除地下水中硝酸盐氮和对氯苯酚的试验研究

赵兰，王婷，吴为中

北京大学环境科学与工程学院，北京 100871

以PHBⅤ为固相碳源同时去除地下水中硝酸盐氮和对氯苯酚的试验研究

赵兰，王婷，吴为中*

北京大学环境科学与工程学院，北京 100871

化肥和农药的施用导致中国的地下水中硝酸盐氮和农药污染同时存在，并成为威胁人体健康的重要因素之一。其中氯酚类物质是一类常见的农药，具有高毒性和难降解性。目前，关于固相反硝化用于硝酸盐氮和对氯苯酚同时去除的研究较少，并且对微生物群落结构演变情况的分析还鲜见报道。论文以聚羟基丁酸戊酸共聚酯（PHBV）为反硝化固体碳源，通过序批试验研究同步去除硝酸盐氮和对氯苯酚的效果，并探讨对氯苯酚的加入对反硝化速率的影响；利用末端限制性长度多态性分析（T-RFLP）技术，使用Alu Ⅰ酶切总细菌16S rRNA，研究对氯苯酚的存在对微生物群落的影响。结果表明，（1）在50 mg·L-1的硝酸盐氮（NO3--N）的浓度水平下，对氯苯酚（4-CP）的加入前后，硝酸盐氮（NO3--N）的去除率为（97.5±1.2）%和（95.3±1.7）%，总体上使去除效果略有降低；在10 mg·L-1的质量浓度水平下，对氯苯酚24 h的平均去除率为45.4%，其去除85.5%是由于微生物的降解作用引起的。（2）从对氯苯酚的加入到第45天的时间内，反硝化速率表现为先下降后上升，说明对反硝化速率起到先抑制后促进的作用。（3）在对氯苯酚加入前后45 d内，系统微生物群落结构发生明显的变化，趋向于多样化和均匀化。

对氯苯酚；硝酸盐氮；固相反硝化；T-RFLP

中国是一个农业大国，由于化肥和农药的施用常同时存在，因而在农药污染严重的地区硝酸盐污染问题也十分严重（Hallberg，1987）。在世界范围内，较多地区的地下水中都存在 NO3--N和农药浓度较高的环境污染问题，而 NO3--N和农药浓度过高，都会对人体健康产生不同形式和不同程度的负面影响，因而寻找经济高效的去除手段是十分必要的（Aslan和Turkman，2006）。

氯酚类物质是一类常见的农药，并且在工业中广泛用做染料和防腐剂等。因为苯环和氯取代基的存在使得其结构十分稳定，进入环境后可长期存在，属于难降解有机物并具有生物毒性（Haggblom，1990）。单氯酚可在饮用水加氯消毒的过程中产生，是农药和氯代芳烃的分解产物（Pritchard，1987）。在一些地区，地下水中的氯酚类物质浓度可以达到相当高的水平，例如在芬兰南部受污染的地下水中检测到氯酚质量浓度达 25～55 mg·L-1（Saia等，2007）。因而地下水中氯酚类物质的去除是保证饮用水水质的关键之一。

固相反硝化是一种新型的反硝化脱氮工艺，以可生物降解聚合物作为反硝化微生物有机碳源，同时充当微生物膜的载体，由于其仅能在微生物酶的作用下缓慢释放有机物质，解决了传统工艺外投加液体碳源（Hallinetal，1996；Menasvetaetal，2001）时存在的用量难以控制，易造成出水的二次污染等问题。研究较为广泛的可生物降解聚合物有：PCL（Boley和Muller，2005；Wang和Wang，2009；Wu等，2013a），PBS（Wu等，2013b），PLA（Fan等，2012），PHBV（Khan等，2007；Mergaert等，2001）等。

目前国内外关于反硝化过程中同步去除农药的研究有一些报道。Aslan和Turkman等（2004）研究了以麦秸为基质同步去除的饮用水中的硝酸盐氮和硫丹（a+β）；Boley等（2006）利用PCL作为反硝化碳源和生物膜载体研究了饮用水中硝酸盐氮和农药（硫丹）的同时去除；Wang等（2013）使用玉米芯作为基质，研究了硝酸盐氮和五氯苯酚的同时去除。但关于农药类有毒物对脱氮效率的影响以及对微生物群落的演变情况还鲜见报道。

论文研究以聚羟基丁酸戊酸共聚酯（PHBV）为固体碳源，通过固相碳源反硝化序批试验，研究NO3--N的反硝化脱氮、对氯苯酚的同步去除效果，探讨对氯苯酚的存在对反硝化效果的影响以及对微生物群落的影响，为固相反硝化用于同步脱氮和去除农药的技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用PHBV为圆柱形固体颗粒，平均高度为3 mm，平均直径为3 mm，每粒质量约为0.02 g，比表面积为21.195 cm2·g-1。实验用水为人工配水，在自来水中加入NaNO3和KH2PO4，使NO3--N和PO43--P质量浓度分别维持在50和10 mg·L-1左右。接种活性污泥取自肖家河污水处理厂二沉池。

1.2 试验方法

（1）接种驯化试验

在250 mL锥形瓶中加入40 g PHBV碳源，加入75 mL活性污泥与75 mL营养液（NO3--N质量浓度为100 mg·L-1，PO43--P质量浓度为10 mg·L-1），采用封口膜封口，在全温振荡培养箱内进行培养，维持25 ℃恒温，转速为100 r·min-1，培养2 d后监测水中的 NO3--N浓度，当 NO3--N质量浓度低于 2 mg·L-1时，更换150 mL配水（NO3--N质量浓度为50 mg·L-1，PO43--P质量浓度为10 mg·L-1），直至每日水中NO3--N质量浓度稳定低于2 mg·L-1时接种挂膜完成。

（2）对照序批试验

全部反应装置均保持每日更换 150 ml配水（NO3--N质量浓度为50 mg·L-1，PO43--P质量浓度为10 mg·L-1）。实验组在每日更换的配水中加入对氯苯酚，并逐日提高浓度，1周后达到目标质量浓度10 mg·L-1。实验组和对照组每日对出水NO3--N浓度进行监测，实验组同时测定水中对氯苯酚浓度。

（3）对氯苯酚对反硝化速率影响试验

进行3组平行实验，3组实验分别在加入对氯苯酚之前、达到目标浓度之后第5、25和45天进行反硝化动力学实验和DNA提取。

（4）对氯苯酚降解试验

随机选取两个实验组，其中一组加入氯霉素抑制微生物活性（Armenante等，1996），两组同时加入试验配水（NO3--N质量浓度为50 mg·L-1，PO43--P质量浓度为10 mg·L-1，对氯苯酚10 mg·L-1），并逐时取样测定水中对氯苯酚浓度来研究对氯苯酚的降解和吸附特性。

（5）生物群落结构研究

按照DNA提取试剂盒（上海，博彩）产品说明书提取细菌总DNA，对16S rRNA基因进行PCR扩 增 ， 扩 增 引 物 序 列 27F： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’； 1492R： 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增正向引物5’端用6-羧基二乙酸荧光素（FAM）标记，引物由上海生工有限公司合成。扩增条件：94 ℃，4 min；94 ℃，1 min，56 ℃，92 s，72 ℃，2 min，30个循环；72 ℃，10 min。得到的扩增产物用限制性内切酶Alu Ⅰ（日本，Takara）在37 ℃条件下酶切1 h，样品委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行基因扫描分析。

对T-RFLP的图谱，采用Peak scanner软件和T-Rex在线分析软件进行分析，去除片段长度在35 bp以下和500 bp以上的片段。

1.3 测定方法

水样经0.45 μm滤膜过滤后，用紫外分光光度法测定 NO3--N浓度。对氯苯酚浓度的测定采用HPLC法，以峰面积定量，C18反相色谱柱，柱温25 ℃，流动相为V(甲醇)∶V(水)=0.8∶0.2，流速为1 mL·min-1。

图1 实验组(加4-CP)和对照组(无4-CP)的反硝化效果Fig. 1 Denitrification performance of the experimental group and control group

2 结果与讨论

2.1 对氯苯酚对反硝化效果的影响

对于 50 mg·L-1的 NO3--N，实验组和对照组NO3--N平均质量浓度分别为(1.23±0.6)、(2.39±0.9) mg·L-1， 平 均 去 除率 分 别 为 (97.5±1.2)%和(95.3±1.7)%，均实现了较好的脱氮效果。但是对比加入对氯苯酚的实验组和对照组的长期反硝化效果可以看出（图1）：在实验期间内，实验组的硝酸盐去除率普遍低于对照组，平均降低2.2%。这说明在对氯苯酚存在的情况下，反硝化菌的活性受到一定程度的抑制，反硝化作用受到影响，硝酸盐氮的去除率略有降低。

在实验组中（图2），对氯苯酚原始质量浓度约为10 mg·L-1，经24 h反应后，平均质量浓度降至5.5 mg·L-1，平均去除率为45.4%，去除效果比较稳定。这表明在试验系统中，存在具有降解对氯苯酚能力的微生物，能够在固相碳源存在的条件下进行对氯苯酚的去除过程。

图2 实验组对氯苯酚去除效果Fig. 2 The removal performance of the experimental group (with 4-CP)

2.2 对氯苯酚的加入对反硝化速率的影响

在加入对氯苯酚之前以及达到目标质量浓度10 mg·L-1后的第5、25和45天分别进行反硝化动力学实验，3组平行实验，结果如图3所示。

图3 4个时间点的反硝化速率Fig. 3 Denitrification rate of four time points

在加入对氯苯酚前，在6 h NO3--N降至5 mg·L-1以下，在刚加入10 mg·L-1的对氯苯酚后的第5天，反硝化速率明显受到抑制，NO3--N降至5 mg·L-1以下需7 h。而在第25天和第45天的实验结果中发现反硝化速率逐渐加快。第 25天的反硝化速率与未加入前的反硝化速率较为接近，而在加入后第45天仅在4.5 h内NO3--N就降至5 mg·L-1以下。这说明对氯苯酚的加入对于反硝化速率起到先抑制后促进的作用。对氯苯酚具有生物毒性，在刚加入时会对部分反硝化微生物产生毒害作用，因而表现为反硝化速率降低；而经过一段适应期后，反硝化菌逐渐适应对氯苯酚的存在，同时对氯苯酚的加入可能会对微生物产生诱导作用，因而使微生物多样性增加，从而促进不同微生物之间的协同作用，表现为反硝化速率的加快。

2.3 反硝化条件下4-CP的降解和吸附

为了研究反硝化条件下生物膜对于对氯苯酚的吸附作用（图4），加入氯霉素来抑制微生物的降解活性。对于初始质量浓度为 10 mg·L-1的对氯苯酚，生物膜在2 h内达到了吸附饱和状态，水中对氯苯酚质量浓度维持在9.0 mg·L-1左右保持不变。在研究降解的过程中发现，微生物对于对氯苯酚的降解呈现一级动力学的规律，在10 h内可以实现对氯苯酚从10 mg·L-1到3.1 mg·L-1的降解，其中吸附作用引起的去除率为 14.5%，对氯苯酚的去除主要依靠微生物降解作用，而生物膜的吸附去除作用并不明显。在王旭明等（2009）以可生物降解餐盒为碳源对于对氯苯酚和硝酸盐同时去除的研究中，对于30 mg·L-1的对氯苯酚，吸附作用引起的去除率为23%。

图4 反硝化条件下对氯苯酚的降解和吸附Fig. 4 Degradation and adsorption under the denitrification condition

2.4 微生物群落多样性变化分析

总细菌 16S rRNA基因 Alu Ⅰ酶切得到的T-RFLP结果中，删去相对峰面积（峰面积/总面积）低于 2%的片段，进行归一化处理。不同时期（分别为加入对氯苯酚前、加入后5、25、45 d对应1、2、3和4）生物样品中的主要片段及其相对峰面积变化如图5所示。

图5 16S rRNA基因T-RFLP结果(AluⅠ)Fig. 5 The T-RFLP result of 16S rRNA gene

加入对氯苯酚前T-RFs数目为9，加入后5 d增加至13种，新出现了T-RFs 323、434、158等，T-RFs 236、108则消失了。T-RFs 79相对丰度逐渐降低，在加入第45天消失，而T-RFs 37、66、147则随时间逐渐增多，在第 45天的样品中成为优势片段。T-RFs 87在加入对氯苯酚前相对丰度近40%，具有绝对的优势性，在加入对氯苯酚后相对丰度显著下降；而T-RFs 147则相反。对氯苯酚的加入使一部分T-RFs消失，新出现更多T-RFs，T-RFs优势性发生明显改变，趋向多样化和均匀化。这说明对氯苯酚淘汰了一部分不具有耐受性的微生物，诱导产生了多种新型微生物，微生物多样性明显增加，原有优势片段对应微生物的优势性降低，不同微生物所占比例更加均匀。

此外，在对氯苯酚的加入对反硝化效果影响的试验中，对氯苯酚的加入使得硝酸盐氮的去除率降低，这与加入对氯苯酚之后优势片段T-RFs 87相对丰度大大降低是有一定关联性的。

3 结论

（1）对照组和实验组的硝酸盐氮平均去除率分别为(97.5±1.2)%和(95.3±1.7)%，对氯苯酚的加入会降低硝酸盐的去除率，实验组相对于对照组平均降低2.2%。对氯苯酚的平均去除率为45.4%。

（2）反硝化速率受对氯苯酚影响，在加入对氯苯酚第5天，反硝化速率降低；第25天恢复到加入前，第 45天反硝化速率提高。体现为先抑制后促进的过程。本实验对氯苯酚的去除主要依靠微生物的降解作用。

（3）对氯苯酚的加入使系统生物群落结构发生很大改变，原有的优势片段相对丰度大大降低，新出现许多新片段，整体趋向于多样化和均匀化。

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总而言之，深基坑项目时市政工程施工的重要组成部分，施工企业要对深基坑工程施工给予足够的重视，做好对工艺的开发以及质量的控制，以此保证工程的顺利进行和有效性。

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Simultaneous Removal of Nitrates and P-chlorophenol Using PHBV As Solid Phase Carbon Source

ZHAO Lan, WANG Ting, WU Weizhong*
College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China

The co-existence of nitrate and pesticide in groundwater resulting from excessive application of fertilizers and pesticides has become one of potential health threats in China. Batch tests using PHBV as solid carbon source were conducted to simultaneously remove nitrate and p-chlorophenol and to further investigate the effect of p-chlorophenol on denitrification and microbial community. Results indicated that at 50 mg·L-1of NO3--N, addition of p-chlorophenol would lower overall removal of nitrate while improve denitrification rate after initial inhibition. At 10 mg·L-1of p-chlorophenol，averageremoval mainly due to biodegradation was found to be 45.4% over 24 hours and corresponding microbial community structure tended to diversity and evenness.

p-chlorophenol; NO3--N; solid-phase denitrification; solid carbon source; T-RFLP

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.02.018

X523

A

1674-5906（2015）02- 0300-05

赵兰，王婷，吴为中. 以PHBV为固相碳源同时去除地下水中硝酸盐氮和对氯苯酚的试验研究[J]. 生态环境学报, 2015, 24(2): 300-304.

ZHAO Lan, WANG Ting, WU Weizhong. Simultaneous Removal of Nitrates and P-chlorophenol Using PHBV As Solid Phase Carbon Source [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(2): 300-304.

国家自然科学基金项目（51378021；50978001）；国家重大水专项（2012ZX07102002）

赵兰（1989年生），女，硕士研究生，主要从事水污染治理技术方面的研究，E-mail: zhaolan0710@163.com *通讯联系人：E-mail: wzwu@ pku.edu. cn

2014-12-27