基于线粒体COI基因序列的4个海域口虾蛄群体的遗传多样性研究

董 鑫, 邢 坤, 隋宥珍, 刘海映

(大连海洋大学 海洋科技与环境学院, 大连 116023)

口虾蛄(Oratosqilla oratoria)隶属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳动物亚门(Crustacea)、软甲纲(Malacostraca)、口足目(Stomatopoda)、虾蛄科(Squilidae)、口虾蛄属(Oratosquilla)[1], 俗称虾爬子、螳螂虾、虾虎等, 具有很高的营养价值和经济价值, 是中国沿海地区重要的经济虾类之一。近年来, 人们对海鲜食品的需求不断增加, 因而加速了人们对海洋经济生物的索取力度, 口虾蛄作为中国近海捕捞的优势种[2],其资源量随着捕捞压力的增大而逐步减小[3], 加之生态环境的不断恶化, 野生口虾蛄资源受到严重威胁, 所以亟需对口虾蛄的种质资源现状进行研究。

目前对口虾蛄的研究多集中在形态学[4]、生物学特征[5], 生理生态[6]和人工育苗[7]等方面, 关于从分子水平上研究其种群遗传多样性的报道也日渐增多,Zhang等[8]用 11个微卫星标记初步分析了葫芦岛、青岛、烟台3个海域口虾群体的遗传多样性状况, 得到观测等位基因数为2～11个不等, 遗传多样性水平较高。张代臻[9-13]等用细胞色素 C氧化酶亚基I(mtDNACOI)标记的方法研究了黄海海域、渤海海域和粤东海域口虾蛄的遗传多样性和遗传结构, 结果显示黄海海域口虾蛄的单倍型多样性和核苷酸多样性水平均高于渤海海域而低于粤东海域。目前尚未见应用线粒体COI标记的方法对包括南北方海域的口虾蛄野生种质资源现状进行综合详细报道。

线粒体DNA(mitochondrial DNA, 简称mtDNA)相对于核DNA具有结构简单、母系遗传、进化速率快、几乎不发生重组、富含系统发育信号等特点, 是作为种属进化研究的良好标记[14]。其中,COI是目前应用最多、结构和进化动力学研究比较清楚的基因之一, 且其能被通用引物所扩增, 所以被广泛应用于动物近缘种间的系统进化研究。本研究对分布于皮口、绥中、青岛、广州 4个海域口虾蛄群体的遗传多样性和遗传结构进行研究, 以期为口虾蛄野生种质资源的合理开发和保护提供分子生物学依据, 并为口虾蛄在COI方面的研究积累更多可利用数据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料是2011年～2013年采集于皮口、绥中、青岛、广州 4个海域的口虾蛄样本, 共计 100只(表1)。样本活体运回实验室后, 置于–80℃冰箱中冷冻备用。

表1 口虾蛄样本采集信息Tab. 1 Oratosqilla oratoria sampling information

1.2 DNA的提取、扩增及测序

用已灭菌的剪刀取口虾蛄背部肌肉组织, 置于加入液氮的研钵中充分研磨, 用购于上海生工的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取, DNA溶解于 TE溶液中, 琼脂糖凝胶电泳检验其纯度后–20℃保存备用。

COI扩增所用引物为通用引物, 引物序列:LCO1490: 5′-GGTCAAATCATAAAGATATTGG-3′和HCO2198: 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。PCR 反应的总体积为 25 μL, 其中 10×Buffer2.5 μL、Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL、dNTPs(各 2.5 mmol/L)2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、DNA 模板 1 μL、ddH2O 补足体积。在Eppendorf PCR仪上进行扩增, 反应程序均为94℃预变性5 min; 94℃变性30s, 50℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 32个循环; 72℃最后延伸10 min。

PCR产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后, 利用凝胶成像系统进行拍照和比较, 挑选较好的 PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序, 测序仪为XL3730基因分析仪。

1.3 外群的选择及序列分析

鬼虾蛄(Squilla empusa)在分类学上与口虾蛄关系密切, 因此本研究选择鬼虾蛄作为外群分析口虾蛄野生群体的亲缘关系[15]。

用 ClustalX 1.83[16]对所测序列进行比对并人工校对。采用Mega4.0[17]软件统计序列的碱基组成、变异位点、简约信息位点、转换和颠换的比率和不同群体间的遗传距离, 并以邻接法[18](Neighbor-Joining,NJ)基于 Kimura双参数(Kimura 2-parameter)模型构建群体和单倍型的系统发育树(以 Bootstrap法[19]1000次重复来检验系统树各分支的置信度)。用DnaSp5.1软件[20]计算群体的单倍型数, 单倍型多态性(Hd), 核苷酸多样性指数(π)及平均核苷酸差异数(K)等。应用 Arlequin3.5软件中的分子方差分析(AMOVA)估算遗传变异的分布和遗传分化系数(F-statistics,Fst)[21]。用软件TCS1.21[22]来分析单倍型的进化网络关系。

2 结果与分析

2.1 COI序列特征及遗传多样性分析

本研究采用的是无脊椎动物通用引物, 对 4个海域口虾蛄COI进行PCR扩增和测序, 共得到100个样本的COI序列, 经 ClustalX 比对后, 去除引物及序列起始的部分序列, 与 GenBank上下载的口虾蛄的同源COI基因序列进行MEGA比对后, 确认得到 585bp的序列。 4个群体的碱基组成基本一致,COI基因序列的A、G、C、T平均含量分别为28.2%、17.6%、17.6%、36.6%, A+T含量(64.8%)显著高于G+T含量(35.2%)4个群体口虾蛄所有序列中共存在简约信息位点54个。转换与颠换的平均比值是7.84,转换高于颠换。

所有样本共定义 35个单倍型, 分别命名为Hap1～Hap35(表2)。在皮口、绥中、青岛和广州共检测到的单倍型数分别为14个、17个、16个和11个。其中5个单倍型涵盖的样本数最多, 分别为Hap1、Hap2、Hap7、Hap8和Hap16。被共享个体数最多的是Hap2, 为皮口, 青岛, 绥中3个海域的26个样本所共享。被两个以上种群共享的单倍型有16个, 被3个以上种群共享的单倍型有7个, 即Hap1、Hap2、Hap6、Hap7、Hap8、Hap16、Hap20。4个群体的单倍型及遗传多样性系数见表3。4个群体的整体单倍型多样性和平均核苷酸多样性值是0.9162和0.0203。单倍型多样性最高的为广州群体(Hd=0.9338), 最低为皮口群体(Hd=0.8783)。核苷酸多样性以广州群体最高(π=0.0049), 以皮口群体最低(π=0.0032)。4个海域中广州群体的遗传多样性最高, 明显高于其他3个海域。

表2 口虾蛄COI序列的核苷酸变异位点及各单倍型的分布Tab. 2 Distribution of nucleotide variation sites and haplotypes in COI sequences of O.oraotoria

表3 基于COI基因序列得出的4个口虾蛄群体遗传多样性参数Tab. 3 Parameters of genetic diversity in 4 O.oratoria populations based on COI sequences

2.2 群体遗传结构分析

利用COI序列比较4个海域口虾蛄种群的遗传分化, 由 Arlequin3.5软件的 AMOVA计算表明, 来自于群体间的遗传差异(84.53%)明显高于来自群体内的差异(15.47%)(表 4)。遗传分化系数(Fst)在广州与皮口群体间最高(Fst=0.9358)(表5)。皮口、绥中、青岛3个群体的Fst值均为负值, 表明3个群体间几乎没有发生遗传分化, 存在高度的遗传同质性; 而广州与皮口、绥中、青岛3个群体间的Fst值(0.9287～0.9358)均较高, 说明广州群体与其他 3个群体间的遗传分化很大。

表4 4个口虾蛄群体线粒体COI变异区序列的AMOVA结果Tab. 4 The result of AMOVA based on COI gene of mtDNA in 4 O.oratoria populations

表5 4个口虾蛄群体间的平均遗传距离和Fst值Tab. 5 Mean distance between 4 O.oratoria populations and Fst

采用MEGE4.0 软件根据Kimura 双参数模型计算各群体间的遗传距离, 由表5可知, 皮口和绥中群体的遗传距离最近, 为 0.00357; 广州和绥中群体的遗传距离最远, 为 0.04574。广州与皮口、青岛、绥中 3个群体间的遗传距离均较远(0.04567～0.04574),皮口、青岛、绥中群体间的遗传距离很近(0.00357～0.00370)。

2.3 系统发育和嵌套分析

从GenBank下载19条粤东海域(汕尾和深圳)的口虾蛄COI序列和鬼虾蛄的COI序列, 与本研究所检测的100条口虾蛄样本的COI同源基因序列构建群体的 NJ系统发育树(图 1), 整体分析系统进化关系。由图1可知, 进化树主要分为3个分支: 皮口、绥中、青岛 3个海域口虾蛄群体遗传距离较近首先聚为一个小支, 与广州和粤东(汕尾和深圳)海域口虾蛄群体相聚的小支聚为一个大支, 最后才与外群鬼虾蛄群体聚在一起。从构建的单倍型NJ系统进化树可以看出(图2), 绥中、青岛、皮口3个海域的口虾蛄的所有个体以嵌套的方式聚集在一起, 没有形成明显的地理格局, 广州群体特有的单倍型形成单独的分支。

基于单倍型的进化网络关系图(图 3)(圆代表单倍型, 斜线代表演变事件, 小圆点代表未检测到的单倍型)可知, 广州群体特有单倍型形成的进化网络关系图独立于皮口、绥中和青岛单倍型形成的进化网络图之外, 形成了明显的地理谱系结构, 广州单倍型与其他3个群体单倍型遗传分化明显。

图1 基于COI基因序列构建的NJ系统进化树Fig. 1 Neighbor-joining tree based on COI gene sequences

图2 35个口虾蛄单倍型的NJ系统进化树Fig. 2 Neighbor-joining tree of 35 O.oratoria haplotypes

图3 口虾蛄群体所有单倍型进化网络关系图Fig. 3 Haplotype network from all haplotypes based on COI sequence of O.oratoria

图3显示, 在皮口、绥中和青岛单倍型形成的进化网络关系图中, Hap2是最主要最原始的单倍型,Hap1、Hap8、Hap9、Hap16、Hap21、Hap23和 Hap24是由其直接拓展而出, 呈星状辐射分布, 其他单倍型由以上 7个单倍型间接拓展出来, 其中由 Hap16拓展出的单倍型数最多, 皮口、绥中和青岛单倍型没有明显的分化, 24个单倍型以相互交错的形式聚合在一起。在广州特有单倍型形成的进化网络关系图中, Hap31是最原始的单倍型, Hap26、Hap29和Hap34以一步突变与其连接在一起, 其他单倍型从以上3个单倍型间接拓展出来, 其中Hap26、Hap27、Hap30和Hap33聚合成一组, 显示出较近的亲缘关系。

3 讨论与结论

本实验所研究的口虾蛄100条COI同源序列中,A、G、C、T的平均含量为28.2%、17.6%、17.6%、36.6%, 这与江苏连云港与盐城海域(A=27.6%、G=17.7%、C=17.6%、T=37.1%)[10]、粤东海域(A=27.1%、G=18.9%、C=17.6%、T=36.4%)[13]、渤海湾葫芦岛海域(A=27.8%、G=17.9%、C=17.6%、T=36.8%)[11]、黄海海域(A=27.5%、G=17.8%、C=17.6%、T=37.1%)[9]所研究的口虾蛄平均碱基组成相当, 说明口虾蛄COI序列具有相似的组成特点。A+T含量(64.8%)明显高于G+C含量(35.2%), 该结果与许多研究者在农田金龟子、虾类、蟹类等COI中观察到的结果相似[23-25],AT含量高是节肢动物线粒体DNA碱基组成中普遍存在的现象。本研究中, 转换与颠换的平均比值是7.84, 转换高于颠换, 说明4个群体中口虾蛄COI序列替换未达到饱和。一般在 mtDNA序列的变异中,转换较易在近亲种间频繁发生, 而颠换则发生在远缘种间, 在同物种内部, 转换高于颠换[26]。

遗传多样性参数是衡量群体遗传多样性程度的重要指标之一。根据线粒体基因序列的单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(π), 将海洋生物的遗传多样性分为 4种类型: 低Hd(<0.5)和低π(<0.5%), 高Hd(>0.5)和低π(<0.5%), 低Hd(<0.5)和高π(>0.5%),高Hd(>0.5)和高π(>0.5%)[27]。本研究中 4个群体的遗传多样性均表现出高的单倍型多样性和低的核苷酸多样性的特点, 因此属于第二种类型, 说明4个海域口虾蛄群体的遗传多样性均处于中等水平。广州海域口虾蛄群体的单倍型多样性和核苷酸多样性均为最高, 可知广州海域口虾蛄的遗传多样性最高。近年来, 虽然中国近海口虾蛄的捕捞量有所下降, 但其现存资源量仍很高[28], 因此, 尽管口虾蛄资源处于过度捕捞的状态, 然而大的资源量仍维持了口虾蛄中等水平的遗传多样性。群体这种高的单倍型多样性和低的核苷酸多样性的特点, 表明物种经历了一个由较小的有效种群在近期快速增长为一个大的种群的过程[27]。本研究中的 4个口虾蛄群体的平均核苷酸多样性(π=0.0203)明显高于粤东海域[13](π=0.00755)、渤海湾[12](π=0.00485)和黄海海域[9](π=0.00512)的口虾蛄群体, 整体单倍型多样性与以上海域研究结果相当, 是由于本研究中的口虾蛄样本来自中国的黄海(皮口和青岛)、渤海(绥中)和南海(广州)3大海域, 取样范围较以往研究都大, 因此口虾蛄的核苷酸多态性高。

遗传距离是评价种群遗传变异差异水平的另一重要指标。根据MEGA4.0计算的遗传距离分析, 皮口和绥中海域口虾蛄的遗传距离最近(0.00357), 广州和绥中海域口虾蛄的遗传距离最远(0.04574)。研究认为, 遗传距离在 0.01以上的, 表示群体的遗传变异较大[29], 广州与其他 3个群体间的遗传差异值均显著大于 0.01, 反映了广州群体较大的遗传变异水平, 这可能是由于广州口虾蛄栖息地保护较好,没有遭到人为破坏, 种群发展比较稳定, 积累的变异较多, 因此遗传变异水平较高; 皮口、绥中、青岛群体间的遗传距离均小于0.01, 表明3个群体的遗传差异较小, 3个海域口虾蛄之间有着频繁的基因交流,这可能是由于口虾蛄为广温、广盐性生态类群, 其生活水温为 6～31℃, 适盐范围为 12～35, 其生存空间范围大, 可以在栖息地渔场及邻近大部分海域移动生存[28]。

群体的NJ进化树显示, 皮口、绥中和青岛3个群体聚为一支, 广州与粤东(深圳和汕尾)群体聚为另一支。5个群体的系统发育关系在一定程度上是由群体的地理位置分布情况决定的, 广州在地理位置上与粤东的深圳和汕尾相近, 而与皮口、绥中、青岛3个海域相距甚远, 这与本实验构建的 NJ进化树结果相一致, 展现了广州群体与其他 3个群体间较远的亲缘关系。从单倍型进化树上也可以看出皮口、绥中和青岛 3个群体的单倍型嵌套聚集形成一支,没有形成明显的地理分化格局, 而广州群体特有单倍型独立形成另一支, 说明广州群体与其他 3个群体间具有显著的遗传分化。口虾蛄群体所有单倍型形成的进化网络关系图也显示出广州群体与皮口、绥中和青岛3个海域的口虾蛄群体间大的遗传分化,结果与单倍型的NJ系统发育树一致。

在线粒体基因组序列中, 受选择压力的不同而导致各个区域进化速率的不同。如 D-Loop 由于不编码蛋白质受到的选择压力少, 所以进化速度较快,比较适用于群体遗传学及近缘种间的分析研究[30]。16S rRNA、12S rRNA及CO氧化酶亚单位等适用于种属间至科级以下分类阶元的探讨[31-32]。COI与Cytb进化速率适中, 适合种群水平差异的研究[33]。

基于对口虾蛄线粒体COI序列的检测, 了解口虾蛄的遗传多样性后, 有助于对其野生资源制定具体的科学的保护措施。本研究获得的遗传多样性较好的广州种群, 遗传多样性相对较低的皮口、绥中和青岛种群, 为以后口虾蛄的科学育苗、野生种质资源保护和合理开发利用提供了新的依据。作者测定的口虾蛄COI序列丰富了GenBank报道的同种同源序列, 提供了更多可供研究的基因片段。今后, 可再进行COI作为DNA条形码对虾蛄科进行物种识别的可行性的探讨[34]。

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