海带和厚叶解曼藻中防污活性物质研究*

李凤超，苏荣国**，王 科，李旭朝，卢 伟

（1.中国海洋大学化学化工学院，山东 青岛 266100；2.海洋化工研究院，山东 青岛 266071）

海洋生物污损是指有害的微型或大型生物在物体表面的有害沉积，是人类开发和利用海洋资源过程中遇到的重大难题之一。它能降低船速增加燃料消耗，严重影响海上钻井平台、防波堤等建筑设施的性能与寿命，给人类造成巨大的经济损失［1－2］。

涂装防污涂层是最为有效、经济的防污方法。海洋防污涂料有着非常悠久的历史，最早可追溯到公元前2000多年［3］。传统的防污涂料如有机锡类防污涂料、氧化亚铜类防污涂料等曾达到了人们所期望的防污效果，但却给海洋生态系统带来了严重的灾害，也间接危害了人类健康［4］。国际海洋组织禁止在2003年1月以后使用含有TBT的防污涂料，并决定到2008年全面禁用有机锡的防污涂料［5］，为此研制开发环境友好型的防污剂和防污涂料成为亟待解决的问题。

天然防污活性物质因对人类及非目标生物无害，对环境无污染、易降解等特点成为新型防污剂研制的重点对象［6］。例如从桉树、辣椒等陆生植物或从海洋植物、海洋无脊椎动物和海洋微生物中提取具有防污活性的天然产物［7］。海藻类植物是海洋中的初级生产者，广泛的分布在世界大洋中，它们能够产生丰富的具有生物活性的次级代谢产物，是天然防污剂重要的潜在来源［8］。

本文以典型的海洋污损生物中肋骨条藻（Skeletonemacostatum）和东方小藤壶（Chthamaluschallengeri）的Ⅱ期幼虫为受试生物研究了海带（Laminar-ia）和厚叶解曼藻（Kjellmaniellacrassifolia）粗提物的防污活性，为天然生物活性物质作为防污剂应用到防污涂料中提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；GXZ-3800型智能光照培养箱（宁波东南仪器厂）；Fluorolog3-11荧光分光光度计（Jobin Yvon，france）；OSB-2100旋转蒸发仪（上海爱明仪器有限公司）；HZQ-F160型全温振荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；f/2营养液；乙醇（AR）天津市富宇精细化工有限公司；二氯甲烷（AR）天津市富宇精细化工有限公司；无水硫酸钠（AR）国药集团化学试剂有限公司。

1.2 生物活性物质的提取

本文所用的海带（Laminaria）和厚叶解曼藻（Kjellmaniellacrassifolia）是由中国海洋大学大型海藻种质资源库提供。两种海藻均属于褐藻门，其中海带“三海”为人工培育的海带品种（Laminariajaponica×Saccharinalatissima），在中国已广泛养殖。将海带和厚叶解曼藻用蒸馏水冲洗干净，然后用5%的乙醇溶液冲洗除去表面的微菌群，用滤纸拭干其表面，室温下阴干。阴干后的原材料磨成粉密封于塑料袋并存放在冰箱中备用。取两种海藻粉各80g于500mL的锥形瓶中，加入95%的乙醇溶液120mL，封口置于恒温（4℃）振荡培养箱中振荡提取4h后收集上层清液。同样的提取过程重复5次。将5次乙醇提取液混合，低温下（＜40℃）于旋转蒸发仪中蒸干，加入蒸馏水（100mL）和二氯甲烷（400mL）溶解后转入梨形分液漏斗中充分振荡30min静置分层。收集二氯甲烷相并加入适量的Na2SO4粉末静置干燥24h，过滤。将二氯甲烷相低温（＜40℃）旋蒸至约5mL，转移到50mL的称量瓶中，用氮气吹干、称重并配制成粗提物溶液［9］。

1.3 抑制海藻生长活性实验

中肋骨条藻（Skeletonemacostatum）为受试藻种，由中国海洋大学海洋生态防污实验室提供。中肋骨条藻是常见的污损硅藻（Diatom），具有极高的抗防污能力［10］。使用过滤后（GF/F，Whatman）的黄海海水配制成F/2-Si营养液［11－12］进行培养，其pH 为8.0±0.1，盐度为30.01±1.0。所用培养容器和营养液均进行高压灭菌处理（120℃，20min），接种后将藻液放在智能光照培养箱内培养，光照强度（E）为3 000～4 000lux、光暗比为12h∶12h、温度为（20±1）℃，每天手工振荡藻液以进行气体交换，培养到指数生长期（105cells/mL）备用。

将指数生长期的中肋骨条藻藻液转入250mL的锥形瓶，每瓶100mL，按设定的浓度梯度加入粗提物溶液摇匀。海带粗提物浓度梯度设定为0，5.0、7.5、10.0、15.0、25.0μg·mL－1，厚叶解曼藻粗提物浓度梯度设定为0，10.0、15.0，20.0、30.0、35.0μg·mL－1，每个浓度梯度设定3个平行样。将其放在温度为（20±1）℃、光照约3 000～4 000lux、光暗比为12h∶12h智能光照培养箱中培养96h，每24h用荧光分光光度计测定叶绿素a的荧光强度（FI），以此反应藻的生长情况［13］。荧光强度的测定条件：室温20～25℃；激发波长为450nm；发射波长为685nm；狭缝宽度为5nm；积分时间为0.05s。

1.4 抑制藤壶幼虫急性毒性实验

藤壶是世界上分布最广、数量最多的一类海洋污损生物。目前，许多国内外学者把藤壶作为生物污损和污损防治的重要研究对象［14－16］。实验所用的藤壶为小藤壶科（Chthamalidea）的东方小藤壶（Chthamalus challengeri）。所用藤壶于2014年5—9月采自青岛太平角石质潮间带。选取藤壶个体大（底基直径大于5nm）且多的岩石，用锤子将岩石敲下带回实验室，用清水将石块洗净后放入盛有新鲜海水的大桶中，加入培养的亚心型扁藻（Platymonassubcordiforus）作为饵料，每天更换新鲜海水。

实验前，将成体藤壶的石块从桶中取出，自来水冲净，阴干后放入新鲜海水中，适当光照刺激，几分钟之后就有藤壶幼虫释放出来。利用幼虫的趋光性用吸管吸出转移到盛有灭菌的海水的烧杯中，投入少量饵料藻液并充气培养12h，获得藤壶Ⅱ期幼虫，选取活泼个体用于实验。

急性毒性试验在24孔聚苯乙烯板中进行，每孔体积3mL。每孔移入30只Ⅱ期藤壶幼虫，按设好的浓度梯度加入粗提物，海带粗提物浓度梯度设定为0，5.0、7.5、10.0、20.0、30.0μg·mL－1，厚叶解曼藻粗提物浓度梯度设定为0，5.0、10.0、15.0、20.0、35.0μg·mL－1，然后补加新鲜海水至2.5mL。每个浓度梯度设3个平行，温度28℃，不投饵，不充气，避光培养。24h后观察并记录结果。计算不同浓度的粗提物对藤壶幼虫的致死率，即每个浓度梯度下死亡的藤壶幼虫数目占总的藤壶幼虫数目的百分比。

1.5 实验数据处理

实验数据采用SPSS软件分析，SPSS软件提供了完整的数据统计分析功能［17］。实验组与对照组的差异运用单向方差分析，再运用Dunnett-t检验（α＝0.05）。以EC50表示粗提取物的抑藻效果，以LC50表示粗提取物对藤壶幼虫的致死效果。EC50是指在一定时间内，引起50%试验生物产生某一特定反应，或是某反应指标被抑制一半时的毒性物质浓度［18］。LC50是指一定时间内，使受试生物死亡一半时所需毒性物质的浓度［19］。

2 结果与讨论

2.1 粗提物对中肋骨条藻生长的抑制作用

图1 不同浓度海带粗提物影响下中肋骨条藻96h生长曲线Fig.1 Growth curve of S.costatumsubjected to different concentrations of the crude extract of Laminaria within 96h

两种粗提物对中肋骨条藻的生长均具有较好的抑制作用（见图1、2）。不同浓度海带粗提物对中肋骨条藻生长的抑制作用随浓度增加而增强（见图1），当海带粗提物浓度为10.0μg·mL－1时，在72h内对中肋骨条藻的生长具有显著抑制作用，在96h后中肋骨条藻逐渐恢复生长；当粗提物的浓度达15.0μg·mL－1时，就可以完全抑制中肋骨条藻的生长。经计算得海带粗提物抑藻的EC50值为（8.9±0.6）μg·mL－1。

图2 不同浓度厚叶解曼藻粗提物影响下中肋骨条藻96h生长曲线Fig.2 Growth curve of S.costatumsubjected to different concentrations of the crude extract of Kjellmaniella crassifolia within 96h

厚叶解曼藻粗提物对中肋骨条藻生长的抑制作用符合量效关系（见图2）。当厚叶解曼藻粗提物的浓度为35.0μg·mL－1时，可完全抑制中肋骨条藻的生长；当其浓度达到30.0μg·mL－1时，可抑制80%以上的中肋骨条藻生长；当其浓度为15.0μg·mL－1时，可抑制40%以上的中肋骨条藻生长；而当其浓度低于10.0 μg·mL－1时，藻的生长基本不受影响。经计算得厚叶解曼藻粗提物抑藻的 EC50值为（17.3±1.2）μg·mL－1。

关于从海洋生物中提取抑藻活性物质，国内外已有相关报道。如海洋真菌（Aureobasidiumpullulans）氯仿萃取物可有效抑制中肋骨条藻的生长，其EC50值为49.4μg·mL－1［20］；孔石莼（Ulvalactuca）的二氯甲烷提取物对三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum Bohlin）生长有抑制作用，其EC50值为300.0μg·mL－1［21］；当囊链藻（Bifurcariabrassicaeformis）的粗提物浓度为30.0μg·mL－1时，可以阻止60%以上大型海藻（如浒苔等）孢子的附着［22］；钝马尾藻（Sargassummuticum）的二氯甲烷提取物可抑制新月菱形藻（硅藻）的生长，其 EC50值为45.5μg·mL－1［23］；铜藻（Sargassumhorneri）的粗提物可抑制硅藻（Navicula annexa）的生长，其 EC50值为1.79μg·mL－1［24］。根据现有的文献报道，本研究所得到的两种海藻粗提物具有较好的抑藻活性。

2.2 粗提物对藤壶幼虫急性毒性作用

由图3可知，海带粗提物对藤壶幼虫有较好的毒性效应，其对藤壶幼虫的致死率随浓度的增大而升高。当海带粗提物浓度达到20.0μg·mL－1时，即可使50%以上的藤壶幼虫死亡；而当其浓度达到30.0μg·mL－1时，对藤壶幼虫的致死率达100%。根据该急性毒性试验结果计算得到海带粗提物对藤壶幼虫的LC50值为（12.0±1.6）μg·mL－1。

图3 海带粗提物对藤壶幼虫的致死率（24h）Fig.3 Lethal effects of the crude extract against C.challengeri larvae after 24hexposure

图4 厚叶解曼藻粗提物对藤壶幼虫的致死率（24h）Fig.4 Lethal effects of the crude extract of Kjellmaniella crassifoliaagainst C.challengeri larvae（24h）

厚叶解曼藻粗提物对藤壶幼虫的致死作用也随着浓度的增大而增强（见图4）。厚叶解曼藻粗提物浓度低于15.0μg·mL－1时，对藤壶幼虫的致死率小于40%；当其浓度增加到20.0μg·mL－1时，可使藤壶幼虫的致死率达到50%；而当厚叶解曼藻粗提物浓度达到35.0μg·mL－1时，藤壶幼虫基本全部死亡。经计算得到厚叶解曼藻粗提物对藤壶幼虫的LC50值为（16.1±2.5）μg·mL－1。

从海洋生物中提取防污活性物质的研究已经受到国内外科技工作者的广泛重视，一些具有较强藤壶幼虫抑制作用的海洋天然活性物质被发现。2009年，Limna Mol等［25］发现海绵（Haliclonaexigua）提取物对纹藤壶幼虫有明显毒性效应，经急性毒性实验得其LC50值为18.07μg·mL－1。海洋真菌（Aureobasidiumpullulans）氯仿萃取物对纹藤壶幼虫也有较强的致死作用，其 LC50值 为 22.2 μg·mL－1［20］；从 柳 珊 瑚（Subergorgiasuberosa）中提取的柳珊瑚酸对纹藤壶幼虫的附着表现出较强的抑制作用，其对纹藤壶幼虫的LC50值为200μg·mL－1［26］。另外，海条藻（Himanthaliaelongata）的二氯甲烷提取物对纹藤壶幼虫的LC50值为96.2μg·mL－1［27］；囊链藻（Bifurcariabifurcate）中提取的代谢产物对藤壶幼虫的LC50值为38.3μg·mL－1［28］。本文中海带和厚叶解曼藻粗提物对藤壶幼虫的 LC50值分别为（12.0±1.6）和（16.1±2.5）μg·mL－1，相比而言具有较强的致死作用。

表1 两种海藻粗提物的生物毒性测试结果Table 1 Biological toxicity test results of the seaweeds/μg·mL－1

3 结语

本文从人工培育海带“三海”和厚叶解曼藻中提取得到具有较强防污活性的物质，其对两种典型污损生物中肋骨条藻和东方小藤壶幼虫具有显著的抑制或致死作用，海带粗提物抑制中肋骨条藻生长的EC50值为（8.9±0.6）μg·mL－1，对藤壶Ⅱ期幼虫急性毒性试验的LC50值为（12.0±1.6）μg·mL－1。厚叶解曼藻粗提物抑藻实验的EC50值为（17.3±1.2）μg·mL－1，对藤壶Ⅱ期幼虫的LC50值为（16.1±2.5）μg·mL－1。研究结果表明，2种海藻提取物均具有较强的生物毒性，可作为环境友好型防污剂的来源进行深入细致的研究。

到目前为止，从海洋藻类特别是褐藻和红藻中提取的生物活性物质多为脂肪酸类、生物碱类、萜类、酚类以及甾醇类化合物［29］。罗先群等［30］研究发现红藻门的细基江蓠藻（Gracilariarenuistipctata）和褐藻门的匍枝马尾藻（Sargassumpolycystum）的乙醚和95%乙醇提取物具有较好的抑菌活性，经进一步的分离鉴定，发现主要的抑菌活性成分为一系列脂肪酸类化合物，如棕榈酸、十八碳烯酸、5，8，11，14-二十碳四烯酸等。Vallim等［31］研究发现褐藻门网地藻（Dictyotacean）的防污活性物质为萜类化合物。Manilal等［32］研究发现红藻门的凹顶藻（Laurenciabrandenii）甲醇粗提物经层析柱梯度洗脱纯化后的组分可抑制藤壶、贻贝的附着，经GC-MS鉴定防污活性成分主要为十八碳二烯酸和棕榈酸。Mautner等［33］首次试验红藻门松节藻（Rhodomelaconfervoides）的提取物有很强的抗菌活性，经鉴定活性物质为溴代酚。海带和厚叶解曼藻的是海洋中普遍存在的褐藻类植物，其防污活性物质应该为中级性的脂肪酸类、萜类或酚类化合物，在进一步研究中需要利用柱层析、红外、高分辨质谱等分离鉴定技术对提取的防污活性物质进行分析。

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