[18F]FPTZFA的合成及显像研究

周达鸣 朱建华

（复旦大学药学院放射药学教研室 上海 201203）

[18F]FPTZFA的合成及显像研究

周达鸣 朱建华

（复旦大学药学院放射药学教研室 上海 201203）

为研究正电子核素18F标记的叶酸衍生物([18F]FPTZFA)的合成及其在小鼠体内的生物学分布，以叶酸为起始原料，通过叶酸上羧基与2-叠氮基乙胺上氨基的成酯反应，将叠氮基团标记至叶酸，得到γ-叶酸-2-叠氮基乙酰胺(FA-N3)；同时以硝基羟基吡啶为原料，经过三步取代反应，将炔基、F连接至吡啶环上得到2-氟-3-(戊-4-炔基氧)吡啶(19F-PyKYNE)。19F-PyKYNE在K18F/K222作用下生成18F-PyKYNE。18F-PyKYNE的炔基与FA-N3的叠氮基团，在硫酸铜、抗坏血酸钠催化下发生点击化学反应，得到最终产物[18F]FPTZFA。整个放射性标记过程仅需40 min，[18F]FPTZFA放化纯度达51%，放化产率达37%。[18F]FPTZFA经放射性半制备高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分离纯化后，观察其在不同时间段荷瘤小鼠体内的组织分布。荷瘤小鼠脏器及组织切片后的放射自显影显示[18F]FPTZFA的摄取集中在肝、肾和肿瘤组织。其中30 min肿瘤组织、肌肉的单位质量组织的放射性占注射剂量放射性的百分比(%ID/g)比值为3.6，肿瘤、血液的%ID/g比值为3.2。初步断定[18F]FPTZFA有较好的肿瘤靶向性。

18F，叶酸，点击化学反应

正电子发射断层成像(Positron Emission Tomography, PET)是研究正电子类放射性显像剂（18F、11C、15O、13N等核素标记显像剂）在生物体内分布的一种功能性显像技术。近年来在医学研究、临床诊断及新药研发等方面都有广泛应用[1]。18F的半衰期为110 min，允许进行一些较复杂的合成标记，成为PET应用中最广泛的放射性核素。叶酸通过细胞表面的叶酸受体的内吞作用进入细胞[2]。研究发现，肿瘤细胞中叶酸受体高度表达[3−4]，对叶酸或以叶酸为靶头的显像剂摄取比正常细胞强。利用放射性同位素标记叶酸，可达到肿瘤靶向诊断或者治疗作用[5]。而叶酸在化学反应中不耐光、不耐热、溶解性差，传统的18F标记叶酸耗时较长、反应产率低[6]。点击化学反应(Click Chemistry)是Kolb[7]提出的一种快速合成含有C-X-C原子链接单元化合物的组合化学方法，其原料易得，操作简单，条件温和，选择性好，产物收率高，易纯化，后处理简单[8]。利用点击化学反应，放射性药物的合成可分为几个部分，重要部分的合成可通过点击化学反应来快速地完成，生成的三唑氮环产物可调节生物动力学，并有效提高正电子发射断层显像或单电子发射计算机断层显像探针的信噪比。点击化学在放射性药物的合成及标记中也得到了更多的关注[9]。

本文将叠氮基团标记至叶酸，将炔基、18F连接至吡啶环，通过叠氮基与炔基的一步反应，将18F标记至叶酸上。以点击化学反应得到[18F]FPTZFA，反应过程约40 min，放化纯度达51%，放化产率达37%。将[18F]FPTZFA进行半制备放射性高效液相色谱分离，收集到99%纯度的[18F]FPTZFA，研究其在荷瘤小鼠体内的分布。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

2-溴乙胺氢溴酸盐（百灵威试剂公司）；叠氮化钠（上海源叶生物有限公司）；叶酸（国药集团化学试剂有限公司）；3-羟基-2-硝基吡啶（百灵威试剂公司）；5-氯-1-戊炔（阿拉丁试剂公司）；四丁基氟化铵（阿拉丁试剂公司）；二环己基碳二亚胺（国药集团化学试剂有限公司）；所用试剂均为分析纯。

Mercury Plus 400 MHz 超导核磁共振波谱仪（美国Varian公司）；电子天平（德国Sartorius公司）；SPD-10A VP高效液相色谱仪（HPLC，日本岛津公司）。

1.2 实验过程

γ-叶酸-2-叠氮基乙酰胺(FA-N3)的合成如图1。

图1 FA-N3的合成反应条件“a”：叠氮化钠，水，75 ºC，21 h；反应条件“b”：2-叠氮基乙胺，二环己基碳二亚胺，吡啶，二甲亚砜，r.t.，24 hFig.1 Synthesis of FA-N3. Situation “a” is sodium azide, H2O, 75 ºC, 21 h and situation “b” is 2-azidoethanamine, DCC, Py, DMSO, r.t., 24 h.

1.2.1 2-叠氮基乙胺的合成[10]

瓶中加叠氮化钠475.9 mg (7.32 mmol)，2-氨基溴乙酸氢溴酸盐500 mg (2.44 mmol)，加入3 mL H2O至溶解，75 ºC下搅拌回流，反应21 h后冰水下冷却，向反应液中加入10 mL无水乙醚，800 mg NaOH（固体），搅拌至NaOH溶解，有机层用无水乙醚(10 mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥过滤，旋蒸得无色油状液体190 mg (2.4 mmol)，产率98%。经薄层色谱鉴定，2-叠氮基乙胺的比移值Rf= 0.4 (EtoAc:MeOH=3:1，磷钼酸显色)。

1.2.2 γ-叶酸-2-叠氮基乙酰胺(FA-N3)的合成[11]

44 mg (0.1 mmol)叶酸，溶解在5 mL二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)中，加87 mg (1 mmol) 2-叠氮基乙胺，20 mg (0.1 mmol)二环己基碳二亚胺(Dicyclohexylcarbodiimide, DCC)，室温反应24 h。反应液抽滤后，去除白色沉淀，将滤液逐滴滴入无水冰乙醚:丙酮=7:3 (100 mL)混合溶液中，待其沉淀，抽滤，用甲醇溶解后旋蒸。HPLC检测：FA相对保留时间(Retention Time) tR=10.74 min，FA-N3的tR=12.12 min，流速0.8 mL·min−1；流动相A：0.1% 三氟乙酸(Trifluoroacetic acid, TFA)的水溶液；流动相B：0.1% TFA的乙腈溶液；梯度条件0 min 5% B、20 min 65% B、22 min 5% B；λ= 254 nm，Global C18色谱柱，200 mm×4.6 mm i.d.）。2-氟-3-(戊-4-炔基氧)吡啶(19F-PyKYNE)的合成路线如图2所示。

图2 19F-PyKYNE的合成反应条件“c”：5-氯-1-戊炔，氢化钠，N,N-二甲基甲酰胺，0 ºC，2 h，60 ºC，24 h；反应条件“d”：1 mol·L−1 四正丁基氟化铵/四氢呋喃溶液，N,N-二甲基甲酰胺，80 ºC，24 hFig.2 Synthesis of 19F-PyKYNE. Situation “c” is 5-Chloro-1-pentyne, NaH, DMF, 0 ºC, 2 h, 60 ºC, 24 h and situation “d”is TBAF/THF, DMF, 80 ºC, 24 h.

1.2.3 2-硝基-3-(戊-4-炔基氧)吡啶的合成[12]

反应瓶中加入107 mg (4.46 mmol) NaH，加入12 mL干燥二甲基甲酰胺(N,N-dimethyl-Formamide, DMF)，冷却至0 ºC，加入500 mg (3.57 mmol)3-羟基-2-硝基吡啶，搅拌，逐滴加入0.9 mL (8.02 mmol) 5-氯-1-戊炔，冰浴反应10 min后恢复至室温，反应2 h，加热至60 ºC，反应45 h。反应液中倒入5 mL水终止反应，乙酸乙酯(10 mL×3)萃取，有机层以饱和盐水反复洗至无色，无水硫酸钠干燥，过滤旋蒸，得浅黄色油状液体590 mg (2.85 mmol)，产率80%。经薄层色谱鉴定，2-硝基-3-(戊-4-炔基氧)吡啶的Rf= 0.4 (石油醚:乙酸乙酯=3:1)。

1.2.4 2-氟-3-(戊-4-炔基氧)吡啶(19F-PyKYNE)的合成[12]

326 mg (1.58 mmol)2-硝基-3-(戊-4-炔基氧)吡啶中，加入5.4 mL的1 mol·L−1四丁基氟化铵/四氢呋喃(Tetrabutylammonium fluoride/Tetrahydrofuran, TBAF/THF)溶液，加入5.4 mL DMF，80 ºC搅拌，反应24 h。反应液中倒入5 mL水终止反应，用乙酸乙酯(10 mL×3)进行萃取，有机层用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋蒸得黄色油状液体。经薄层色谱鉴定，19F-PyKYNE 的Rf= 0.8 (石油醚:乙酸乙酯=3:1)，柱层析分离得19F-PyKYNE 115 mg (0.6 mmol)。[19F]FPTZFA的合成如图3所示。

1.2.5 [19F]FPTZFA的合成[13]

5 mg (10 μmol)FA-N3溶解在300 μL 0.1 mol·L−1NaOH溶液中，加入3 mg CuSO4，2 mg VcNa，加入5 μL (28 μmol)19F-PyKYNE，超声反应20 min。取10 μL 反应液离心过滤，取上清液以HPLC鉴定：FA的tR=10.74 min，FA-N3的tR=12.17 min， [19F]FPTZFA的tR=14.12 min（流速0.8 mL·min−1；流动相A：0.1% TFA的水溶液；流动相B：0.1% TFA的乙腈溶液；梯度条件0 min 5% B、20 min 65% B、22 min 5% B；λ = 254 nm，Global C18色谱柱，200 mm ×4.6 mm i.d.），并以质谱进行鉴定，m/z: 689 (M+H+)。[18F]FPTZFA的合成如图4所示。

图3 [19F]FPTZFA的合成 反应条件“e”：0.1 mol·L−1 NaOH，D-异抗坏血酸钠，硫酸铜，超声反应Fig.3 Synthesis of [19F]FPTZFA. Situation “e” is NaOH solution, VcNa, CuSO4, ultrasound.

图4 [18F]FPTZFA的合成反应条件“f”：K18F/K222，无水乙腈，二甲亚砜，150 ºC；反应条件“g”：0.1 mol·L−1 NaOH，D-异抗坏血酸钠，硫酸铜，超声反应Fig.4 Synthesis of [18F]FPTZFA. Situation “f” is K18F/K222, CAN, DMSO, 150 ºC and situation “g” is NaOH solution, VcNa, CuSO4, ultrasound.

1.2.6 2-18F-3-(戊-4-炔基氧)吡啶(18F-PyKYNE)的合成[14]

锥形反应管中，150 ºC N2流保护下加入0.5 mL的K18F/K222溶液3.81×108Bq，加入1 mL无水乙腈，吹干，再次加入1 mL无水乙腈，吹干。加入溶解在300 μL DMSO中的5 mg (24 μmol) 2-硝基-3-(戊-4-炔基氧)吡啶，反应15 min，将反应液通过注射器抽吸打入到经5 mL乙醇、5 mL水活化后的C18小柱，5 mL×2蒸馏水洗去游离F，1.5 mL无水乙腈洗，取滤液，得到18F-PyKYNE，测其放射性为2.15×108Bq。

1.2.7 [18F]FPTZFA的合成[13]

另取一反应管，将5 mg (10 μmol) FA-N3超声作用下溶解在300 μL0.1 mol·L−1的NaOH溶液中，加3 mg CuSO4，2 mg VcNa，1.56×108Bq的18F-PyKYNE，超声下反应20 min，取10 μL 反应液离心过滤，取上清液经放射性HPLC鉴定。[18F]FPTZFA的tR=14.33 min（流速0.8 mL·min−1；流动相A：0.1% TFA的水溶液；流动相B：0.1% TFA的乙腈溶液；梯度条件0 min 5% B、20 min 65% B、22 min 5% B； λ=254 nm，Global C18色谱柱，200 mm×4.6 mm i.d.）。反应得到的[18F]FPTZFA经半制备放射性HPLC进行分离。

1.3 小鼠体内分布研究

取三只荷人源口腔上皮细胞癌细胞（KB细胞）瘤雄性小白鼠，尾静脉注射分离纯化后的[18F]FPTZFA，标为A、B、C号。分别注射200 μL、1.52×106Bq的[18F]FPTZFA。并于30 min、60 min、90 min后，摘眼球取血200 μL，解剖取心、肝、脾、肺、肾、脑、左腿肌肉和肿瘤进行γ计数测量，计算[18F]FPTZFA在以上各脏器及组织中的%ID/g。

2 结果与讨论

2.1 [18F]FPTZFA的HPLC分析

在[18F]FPTZFA的合成标记中，未完全反应的18F−离子经C18柱吸附并水洗除去，离心过滤后取澄清液进行放射性HPLC鉴定，并以冷实验所制备的[19F]FPTZFA的HPLC图谱对照，[18F]FPTZFA与[19F]FPTZFA保留时间一致。反应所得的[18F]FPTZFA放化纯度达51%，整个反应的最终标记产率37%（校正后，n=5），经半制备分离后的[18F]FPTZFA纯度为99%。[19F]FPTZFA及[18F]FPTZFA的HPLC图谱如图5所示。

图5 [19F]FPTZFA的HPLC图谱(a)及[18F]FPTZFA的放射性HPLC图谱(b)Fig.5 HPLC chromatography of [19F]FPTZFA (a) and radio-HPLC chromatography of [18F]FPTZFA (b).

2.2 [18F]FPTZFA在荷瘤小鼠的体内分布

因18F半衰期为110 min，选择30 min、60 min、90 min时相考察[18F]FPTZFA在小鼠体内的组织分布(表1)。荷瘤小鼠的脏器及组织切片的%ID/g结果显示，[18F]FPTZFA在30 min、60 min、90 min时在肿瘤部位均有一定浓集。30 min时[18F]FPTZFA在肿瘤、肌肉的%ID/g比为3.6，肿瘤、血液的%ID/g比为3.2；60 min时在肿瘤、肌肉的%ID/g比为6.4，肿瘤、血液的%ID/g比为4；90 min时[18F]FPTZFA在肿瘤、肌肉的%ID/g比为5.7，肿瘤和血液的%ID/g比为3.8。三只小鼠肿瘤组织的%ID/g均高于相应的肌肉组织与血液。

将荷瘤小鼠的心肝脾肺肾脑肌肉肿瘤切片，血液待其凝固后取相似大小放置于同一片保鲜膜上，用另一片保鲜膜覆盖压片，放置于磷屏上，暗室曝光。15 min后取出磷屏，置于磷屏仪中，采集信号，其放射自显影结果如图6所示。

表1 [18F]FPTZFA在荷瘤小鼠的脏器及组织(%ID/g)分布Table 1 Biodistribution of [18F]FPTZFA in tumor mice (%ID/g).

图6 荷KB瘤小鼠脏器及组织放射自显影成像Fig.6 Radio autoradiography imaging in KB tumor-bearing mice.

3 讨论

在FA-N3的合成中，由于叶酸含有两个羧基，分别为α位羧基和γ位羧基，缩合反应后可生成单取代的叶酸与双取代的叶酸两种混合产物。本文采取叶酸:2-叠氮基乙酰胺:DCC=1:10:1的当量，过量的2-叠氮基乙酰胺可以控制只生成单取代的叶酸。

在F-PyKYNE的合成中，冷实验与热试验采取不同的F离子来源。本文遵循传统热试验中采取K18F作为18F离子的来源[15−18]，进行快速的微量反应。而冷实验中则参照文献[12]的做法，选择TBAF/THF溶液作为19F离子来源，反应产率更高，可以得到大量19F-PyKYNE作为热实验对照物。

在[18F]FPTZFA的合成中，由于单取代的FA-N3难溶于水，必须在NaOH溶液溶解后Click反应才得以进行。

本文以叶酸为起始原料，通过控制投料比，选择不同F来源，调整反应体系酸碱度等方法提高反应产率。通过半制备高效液相色谱分离，解决叶酸衍生物极性过大难以纯化的缺点。放射性标记则一步反应得到[18F]FPTZFA，标记时间持续约40 min，反应高效，耗时少。所得[18F]FPTZFA的放化纯度达51%，整个反应的最终标记产率37%（校正后，n=5），经半制备高效液相色谱分离后的[18F]FPTZFA纯度达99%，与传统过程中18F标记叶酸相比[19]，反应时间更短，收率更高，纯度更高。

离体实验中，荷瘤小鼠的脏器及组织 %ID/g显示[18F]FPTZFA在肝肾中特别是肾脏中有着较大的%ID/g。除肝肾外，肿瘤组织的%ID/g最高，且明显高于相对应的肌肉与血液，初步断定[18F]FPTZFA有较好的肿瘤靶向性。脏器切片后的放射自显影也显示 [18F]FPTZFA在肿瘤组织中浓集，与%ID/g结果相一致。

4 结语

以叶酸为载体的肿瘤特异性诊断研究在国内外已有较多报道，如利用放射性同位素包括111In67Ga、99mTc等标记叶酸，达到肿瘤显像的目的。以正电子核素18F标记叶酸，加以应用点击化学反应使得18F标记过程更为快速高效，其标记产物的临床应用前景也更为广阔。本文通过点击化学反应所得的[18F]FPTZFA标记产率为37%，放化纯度达51%，耗时40 min，在荷瘤小鼠肿瘤组织中有较高浓集，显示出较好的肿瘤靶向性，可为18F标记叶酸衍生物的合成及动物显像研究提供一定的参考价值。

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CLC TL99

Synthesis and imaging study of [18F]FPTZFA

ZHOU Daming ZHU Jianhua
(Department of Radiopharmacy, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China)

Background: Folate receptor is highly expressed in tumor cells. Labeling folic acid offers a way of tumor targeting. Purpose: This study aims to explore the synthesis and in vivo imaging of18F labeled folic derivative [18F]FPTZFA. Method: Starting from folic acid, through the amino and carboxyl ester forming reaction, we get FA-N3, and then FA-N3is labeled with18F-Pykyne in the presence of CuSO4, VcNa to get the compound of [18F]FPTZFA. [18F]FPTZFA then characterized by Radio-HPLC (High Performance Liquid Chromatography) and separated by Semi-HPLC. In vivo imaging was carried out in KB tumor-bearing nude mice after intravenous injection of [18F]FPTZFA via tail vein and biodistribution of [18F]FPTZFA was performed in these mice. Results: The overall reaction time lasts for 40 min, with radiochemical purity of 51%, and radiochemical yield of 37%. The autoradiography of mice tissues showed [18F]FPTZFA concentrated in liver, kidney and tumor. The %ID/g ratio in tumor tissue and muscle is 3.6, %ID/g ratio in tumor tissue and blood is 3.2. Conclusion: The high efficiency and high yield make the synthesis of [18F]FPTZFA more convenient and the %ID/g ratio indicates [18F]FPTZFA as a promising tumor targeting tracer.

18F, Folic acid, Click chemistry

TL99

10.11889/j.0253-3219.2015.hjs.38.020301

国家重点基础研究发展973计划(No.2013CB932502)资助

周达鸣，女，1989年出生，2013年于复旦大学获硕士学位，研究领域为放射性药物

朱建华，E-mail: jhzhu@shmu.edu.cn

2014-10-11，

2014-10-31