正交设计法优化槐花中总黄酮的提取工艺

邝嘉乐，岑志芳*，何汝邦，杨凤聘，郑少娟，罗国荣

（1.佛山科学技术学院医学院，广东佛山528000；2.佛山市第三人民医院药剂科，广东佛山528000；3.佛山市第五人民医院药剂科，广东佛山528000）

正交设计法优化槐花中总黄酮的提取工艺

邝嘉乐1，岑志芳1*，何汝邦2，杨凤聘3，郑少娟3，罗国荣1

（1.佛山科学技术学院医学院，广东佛山528000；2.佛山市第三人民医院药剂科，广东佛山528000；3.佛山市第五人民医院药剂科，广东佛山528000）

目的优选出槐花提取的最优工艺。方法以槐花中所含总黄酮含量为评价指标，采用L9（34）正交试验法，从药材的粉碎度、碱的种类、提取次数这3个因素中筛选出槐花提取的最优工艺。结果综合各种因素，槐花最佳的提取工艺条件为C1B3A1，即将槐花粉碎成粗粉，用石灰水调pH8，提取3次。结论本方法可为提高槐花中总黄酮的提取率提供依据。

槐花；总黄酮；正交设计试验

槐花（Sophora japonica L.）又名槐蕊，为豆科植物槐的干燥花朵，槐花味苦、性微寒，归肝、大肠经；广泛分布于全国各地，生用或炒炭入药。槐花具有凉血、止血、清肝泻火等功效。对痔血、便血、肝热目赤、头痛眩晕等的治疗效果十分显著［1］。槐花的提取物总黄酮具有一定的抗炎、抗菌、抗病毒、止血、凝血、降血脂等影响心血管系统的作用［2］。

槐花中的黄酮类化合物主要是芦丁和槲皮素。黄酮几乎不溶于苯、醚、氯仿及石油醚；一般能溶于水、乙醇、甲醇、吡啶及碱性溶液中。黄酮类物质的提取方法主要有醇提取法，碱提酸沉法，热水提取法，超声提取法和回流提取法等［3-7］。

目前总黄酮中的主要成份芦丁已被广泛用于医药、保健食品和化妆品中［8］，芦丁产品的应用范围和疗效不断地扩大，使芦丁的需求量进一步增大。我国芦丁生产主要以槐花为原料进行提取，由于槐花产量与气候和节气因素紧密相关，这对整个植物提取行业都有很大的影响，因此，芦丁的价格也有较大的波动。本试验用正交试验设计对总黄酮的提取工艺进行考察，优选高效的提取工艺，对于改变芦丁资源短缺、生产成本高的现状有重要意义。

1 试剂及仪器

1.1 实验仪器

UV1600pc型可见紫外分光光度计（美谱达公司）；BS-110S型电子天平（德国赛多利斯）；真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；HH-S2数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；

1.2 实验试剂

芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号100080-200707）；槐花（产地为陕西购于广州市花都区东升中药制药厂，批号：110705）；亚硫酸钠、硼砂、氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钠、盐酸、甲醇等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取方法［9］

碱提取酸沉淀加抗氧剂法：称取槐花20 g加亚硫酸钠0.5 g作抗氧剂，加0.4％硼砂溶液1 000mL，根据L9（34）正交设计试验表分次提取见表1，水浴温度80℃［10］每次30 min，合并滤液于50～60℃用盐酸调pH到2～3，低温放置24 h，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤至pH=7左右，60℃真空干燥至恒重，称定重量。

2.2 总黄酮含量的测定［1］

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品20.5mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10mL，置100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1mL中含芦丁0.205 mg）。

2.2.2 标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液0.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL，6.0mL分别置于25mL量瓶中，各加水使成至6.0mL，各加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，摇匀，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以第一管为空白，在500 nm波长处测定吸光度，以芦丁对照品的浓度（c）为横坐标，吸收度（a）为纵坐标，得回归方程a=11.553 57C-0.002 76；r=0.999 9。表明芦丁对照品在0.016～0.048mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称取正交试验项下各芦丁样品0.005 0 g，用甲醇溶液溶于250 mL的容量瓶中，精密吸取上述溶液1mL置于50mL的容量瓶稀释至刻度。

2.2.4 样品测定

取已制备好的供试品溶液在500 nm波长处测定吸光度并计算芦丁的含量,结果见表2；采用SPSS16.0统计软件对实验数据进行处理，方差分析结果见表3［11］。

表2 L9（34）正交设计试验结果表

（续上表）

表3 方差分析表

由表3方差分析结果可知，碱的种类这个因素对总黄酮的提取有显著影响。综合分析后得出提取最佳工艺条件为C1B3A1，即碱的种类为石灰水、提取3次、药材为粗粉。

3 讨论

（1）以槐花中提取得到总黄酮含量为考察指标，综合表2、表3的结果可知，影响槐花中总黄酮提取率的因素由大到小依次为C＞B＞A，再综合各水平因素可得出最佳的提取工艺条件为C1B3A3。由于A3和A1的R相差不大，证明了药材的粉碎度对总黄酮的提取影响不大。从节约成本和操作的简便性考虑和分析，得出最佳的提取工艺条件为C1B3A1，即将槐花粉碎成粗粉，用石灰水调pH=8，提取3次。

（2）确正试验∶采用上述最佳提取工艺，在其它条件不变的前提下进行确正试验，得出的结果是总黄酮的提取率为10.12％。

（3）通过本次实验研究，发现碱性条件下有利于提高提取率，但芦丁分子含有邻二酚羟基，其性质不稳定，特别是暴露于空气时会缓慢分解变成暗褐色，也特别容易被氧化分解。鉴于此，本实验在碱提取酸沉淀方法的基础上，加入适量抗氧化剂亚硫酸钠、缓冲剂硼砂，以保护芦丁结构上的邻二酚羟基，减少其氧化分解变质，并且增加其溶解度，从而提高提取率，此外，还能提高产品纯度。石灰水对总黄酮的提取影响较大。这是因为槐花中含有芸香苷、槲皮素、槐米甲、乙、丙素以及皂苷、鞣质、粘液质、树脂等［12］。加入的石灰水pH严格控制在pH8，这样既可达到碱溶解提取荟香苷目的，又能使槐花中含存的大量多糖类和粘液质生成钙盐沉淀除去。碳酸钠和氢氧化钠的pH值过高，在加热提取过程中可促使芸香苷水解破坏，造成总黄酮产率下降。所以总黄酮的提取不应用过强的碱调pH，以免破坏其成分导致产率下降。

（4）参考有关文献，发现槐花中总黄酮的最佳提取温度是80℃［13］，故本文在采用80℃的温度进行提取。另外，相关文献中提及多种的提取方法，如醇提取法，碱提酸沉法，热水提取法，超声提取法和回流提取法等［2-6］。但考虑到实际的实验条件和实验时间有限，所要求的操作水平也较高等原因，故选用碱提酸沉法。总黄酮的测定方法也有很多种,如分光光度法、高效液色谱法、薄层扫描法、GC-MS法、毛细管电泳法（CE）、毛细管区带电泳法（GZE）等［14］，从测定成本和实用性考虑，最终采用较权威也较简便的《中国药典》中的紫外分光光度法测定。

［1］国家药典委员会.2010版中国药典一部［M］.北京:化学工业出版社,2010:333-334.

［2］董晓宁,赵强,王俊峰.槐花中芦丁的正交提取工艺及抗氧化活性研究［J］.畜牧与饲料科学,2010,31（2）:11-13.

［3］朱晓娜,曹伟伟,李明静.十二烷基苯磺酸钠超临界二氧化碳萃取槐花总黄酮的工艺研究［J］.化学研究,2012,23（2）: 73-77.

［4］刘海兴,刘凤芹,于爱民,等.毛细管电色谱法测定槐花、槐角中总黄酮含量［J］.化学试剂,2006,28（6）:349-350.

［5］利君,吴振辉,蔡创海.槐花中黄酮类物质提取工艺的研究［J］.农业工程学报,2002,18（1）:142-144.

［6］MIN Jing,YOU Shuang,DING Lan,et al.Microwave-assisted Extraction of Rutin and Quercetin from Flos Sophorae［J］. CHEM.RES.CHINESE U,2004,20（6）:703-706.

［7］HUANG Qiong,TIAN Yuhong,LIN Cuiwu,et al.Study on Extraction Technology of Total Flavonoids from Medicinal Plant Vitex negundo L.var.cannabifolia（Sieb.et Zucc.）Hand.-Mazz［J］.Medicinal Plant,2011,2（4）:51-52.

［8］臧志和,曹丽萍,钟铃.芦丁药理作用及制剂的研究进展［J］.医药导报,2007,26（7）:758-760.

［9］建国,彭小根.槐米中芦丁的提取工艺条件研究［J］.食品工程,2009,1（1）:44-46.

［10］日丽.正交试验优选槐花中总黄酮提取工艺［J］.广州化工,2012,40（12）:75-76.

［11］廖华卫,邓金梅,宋粉云.正交法优化槐米中芦丁的提取工艺［J］.广东药学院学报,2006,22（3）:275-276.

［12］侯丽丽,张守勤,梁清.槐花黄酮提取方法的比较［J］.安徽农业科学,2011,39（7）:3971-3982.

［13］赵宇新.芦丁分解速度与加热温度的相关性［J］.中国实验方剂学杂志,2011,17（18）:101-103.

［14］李飞,李秋红,李延利.槐米有效成分含量测定方法研究进展［J］.中医药信息,2008,25（4）:19-21.

【责任编辑：邓军文dengjunwen69@126.com】

Optimization of extraction technology of total flavonoids in Sophora japonica L.by orthogonal design test

KUANG Jia-le1,CEN Zhi-fang1,HERu-bang2,YANG Feng-ping3, ZHENG Shao-juan3,LUO Guo-rong1

（1.Medical School,Foshan University,Foshan 528000China; 2.Pharmacy Department,The Third People Hospital of FoShan,Foshan 528000China; 3.Pharmacy Department,The 5th People Hospitalof FoShan,Foshan 528000China）

Objective To preferred the optimum extraction technology from the Sophora japonica L.Methods Took the extraction rate of total flavonoids contained in Sophora japonica L as the evaluation index.Using L9（34）orthogonal design experiment,3 factors such as medicinal material grinding degree,kind of alkali,extraction times were screened for Sophora japonica L extraction optimum process.Results Considered all kinds of factors, the optimal extraction conditions of the Sophora japonica L is C1B3A1,that is the Sophora japonica L is crushed into coarse powder,adjusting pH with limewater,extracting 3 times.Conclusion This method provides a basis for improvement of extraction of total flavonoids from Sophora japonica L rate.

Sophora japonica L;total flavonoids;orthogonal design experiment

TQ460.6

A

1008-0171（2015）05-0048-04

2015-06-26

佛山市科技局立项项目（201308119）

邝嘉乐（1981-），男，广东佛山人，佛山科学技术学院讲师。

*通信作者：岑志芳（1971-），女，广东三水人，佛山科学技术学院高级实验师。