二甲双胍对HaCaT细胞增殖及miR-21-5p和PDCD4表达的影响

江萌 马伟元 孙青

二甲双胍对HaCaT细胞增殖及miR-21-5p和PDCD4表达的影响

江萌 马伟元 孙青

目的 探讨二甲双胍对角质形成细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法 以HaCaT细胞为研究对象，分别给予不同浓度二甲双胍（25、50、75、100 mmol/L）刺激24 h，CCK8法检测HaCaT细胞增殖活性；实时定量PCR法检测HaCaT细胞中miR-21-5p及其下游靶基因PDCD4 mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法检测HaCaT细胞中PDCD4蛋白表达水平。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。结果二甲双胍可抑制HaCaT细胞增殖，25、50、75、100 mmol/L二甲双胍作用于HaCaT细胞24 h后，细胞抑制率分别为5.43%±3.67%、19.61%±6.95%、45.93%±9.56%、61.91%±6.93%，各组细胞抑制率差异有统计学意义（F=246.90，P<0.05）；25 mmol/L组与对照组（0.00%±3.00%）相比，差异无统计学意义，其余各组抑制率均较对照组显著增高（P<0.05）；实验组不同浓度组间比较，差异也均有统计学意义（P<0.05）。25、50、75、100 mmol/L 二甲双胍实验组miR-21-5p mRNA相对表达量（2-ΔΔCt）分别为0.90±0.11、0.33±0.05、0.21±0.07、0.14±0.04，PDCD4 mRNA相对表达量（2-ΔΔCt）分别为2.11±0.64、7.22±1.13、11.16±1.23、19.12±3.16，各组细胞miR-21-5p mRNA和PDCD4 mRNA的表达差异均有统计学意义（F值分别为36.99和96.26，均P<0.05）；25 mmol/L组与对照组相比，差异无统计学意义，其余各组miR-21-5p及PDCD4 mRNA的表达均较对照组显著下调或上调（均P<0.05）；实验组不同浓度组间比较，差异也均有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，25、50、75、100 mmol/L二甲双胍实验组PDCD4蛋白表达明显升高，其相对表达量分别为1.22±0.08、2.09±0.20、2.26±0.11、2.37±0.07，组间表达差异有统计学意义（F=75.37，P<0.05）。25 mmol/L组与对照组相比差异无统计学意义，其余各组均较对照组明显升高（P<0.01）。结论 二甲双胍在体外能够显著抑制HaCaT细胞的增殖，可能通过下调miR-21-5p的表达，使其下游靶基因PDCD4表达上调，从而发挥抑制细胞增殖的作用。

角蛋白细胞；二甲双胍；银屑病；细胞增殖；miR-21-5p；PDCD4；HaCaT细胞

二甲双胍（metformin）作为一种胰岛素增敏剂，是临床治疗2型糖尿病的一线药物［1］。近年来体外研究证实，二甲双胍可显著抑制多种肿瘤细胞的增殖［2-5］，但其对皮肤角质形成细胞的作用尚不清楚。miR-21-5p及其下游靶基因PDCD4（programmed cell death 4）在多种肿瘤中存在异常表达［6］。在角质形成细胞异常增殖性疾病如银屑病中，其皮损内miR-21-5p的表达也显著上调［7］。然而关于二甲双胍对miR-21-5p与PDCD4在角质形成细胞中表达的影响及两者之间的相互关系，目前国内外鲜有报道。本研究以HaCaT细胞为研究对象，通过探讨二甲双胍对HaCaT细胞增殖及miR-21-5p和PDCD4表达的影响，为二甲双胍在角质形成细胞异常增殖性疾病中的应用提供一定的理论支持。

一、材料

1.细胞株：HaCaT细胞（美国ATCC公司），由本实验室-70℃冻存。

2.主要试剂：0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液、DMEM高糖培养液、胎牛血清（美国Gibco公司）；CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所）；一步法反转录试剂盒、SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒（瑞士Roche公司）；miRNA qRT-PCR检测试剂盒（广州复能基因有限公司）；二甲双胍（美国Sigma公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；DEPC及无RNA酶水（北京索莱宝生物技术公司）；氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为分析纯（国药集团上海试剂公司）。BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液（强）、PVDF膜、ECL化学发光试剂盒（碧云天生物技术公司）；兔抗人PDCD4多克隆抗体（英国Abcam公司）；鼠抗β肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG以及山羊抗鼠IgG（美国Santa Cruz公司）。

二、方法

1.CCK8法检测二甲双胍对HaCaT细胞增殖的影响：将HaCaT细胞稳定传代3次后分组，①对照组：未加二甲双胍刺激；②实验组：分 4 组，分别加入 25、50、75、100 mmol/L 二甲双胍。取对数生长期HaCaT细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，以密度为2×104/ml接种到96孔板上，每孔100μl，每组处理因素设置3个复孔，同时设置空白组，即培养基+CCK8试剂。待细胞贴壁长至70%融合时用于实验，吸弃孔内培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次，加入100μl含有不同浓度二甲双胍的无血清DMEM培养液培养24 h进行生长同步化。之后每孔加入10μl CCK8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1 h，选择450 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度（A值），实验重复3次取平均值。细胞抑制率=［1-（实验组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）］×100%。

2.实时定量PCR法检测二甲双胍刺激后HaCaT细胞中miR-21-5p及PDCD4 mRNA表达水平：25～100 mmol/L二甲双胍刺激HaCaT细胞24 h后，按Trizol说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度。cDNA的合成操作严格按反转录试剂盒说明书进行，miR-21-5p采用poly A加尾法反转录合成cDNA。实时定量PCR检测miR-21-5p mRNA表达水平，以U6作为内参照，引物由广州复能基因有限公司生产，反应条件：95℃预变性10min，95℃变性10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸10 s，循环40次。检测PDCD4 mRNA表达水平，以β肌动蛋白作为内参照，引物PDCD4及β肌动蛋白由生工生物工程（上海）股份有限公司代为合成，引物序列PDCD4上游 5′-CCCGAGGGATTCTGAAGGAAG-3′，下游 5′-TCACCGGAAAAGAGAGAGTCAC-3′，β 肌动蛋白上游 5′-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游 5′-CCTTCACC GTTCCAGTTT-3′，反应条件：95 ℃预变性 20 s，95 ℃变性 3 s，55℃退火30s，55℃延伸30s，循环40次。每个样品重复3次，根据循环阈值（Ct值）计算miR-21-5p及PDCD4 mRNA的相对表达量。计算公式：△Ct值=目的基因Ct值-内参基因Ct值，△△Ct=△Ct实验-△Ct对照。以对照组目的基因表达量为1，2-△△Ct值即为实验组目的基因较对照组目的基因表达的倍数。

3.蛋白免疫印迹法检测二甲双胍刺激后HaCaT细胞中PDCD4 蛋白表达水平：25、50、75、100 mmol/L 二甲双胍刺激HaCaT细胞24 h后，预冷的PBS冲洗2遍，加入RIPA裂解液于冰上裂解30min后，13 690×g离心10min；吸上清，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度后，加入6×上样缓冲液混匀煮沸5min，取约40μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转印至PVDF膜上；5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入鼠抗β肌动蛋白单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗人PDCD4多克隆抗体（1∶2 000），4℃孵育过夜；洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG以及山羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释），室温孵育1h，洗膜3次，ECL化学发光法进行检测，实验重复3次。所有目的蛋白条带均以β肌动蛋白为内参进行校正，图像处理用Image J分析软件进行目的蛋白相对灰度值分析。

4.统计学处理：采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，数据以±s表示，多组数据之间的分析采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

三、结果

1.二甲双胍对 HaCaT细胞增殖的影响：25、50、75、100 mmol/L二甲双胍刺激HaCaT细胞24 h后，细胞抑制率分别为（5.43±3.67）%、（19.61±6.95）%、（45.93±9.56）%、（61.91±6.93）%，组间差异有统计学意义（F=246.90，P＜0.05），25 mmol/L组与对照组（0.00%±3.00%）相比，差异无统计学意义（q=1.49，P＞0.05），其余各组抑制率均较对照组显著增高（q值分别为5.42、12.69、17.09，P＜0.05或P＜0.01）；50、75、100 mmol/L 组与 25 mmol/L 组相比，差异有统计学意义（q值分别为3.93、11.19、15.60，均P＜0.05）；75、100 mmol/L组与50 mmol/L组相比，差异有统计学意义（q值分别为7.27、11.67，均P＜0.05）；100 mmol/L浓度组与75 mmol/L组相比，差异有统计学意义（q=4.41，P＜0.05）。二甲双胍能显著抑制HaCaT细胞增殖且呈明显的浓度依赖性。

2.二甲双胍对HaCaT细胞miR-21-5p及PDCD4 mRNA表达的影响：25、50、75、100 mmol/L 二甲双胍组 miR-21-5p mRNA相对表达量分别为0.90±0.11、0.33±0.05、0.21±0.07、0.14±0.04。组间表达差异有统计学意义（F=36.99，P＜0.05）。25 mmol/L组与对照组相比差异无统计学意义（q=1.79，P＞0.05），其余各组均较对照组显著下调（q值分别为10.21、12.02、13.10，P＜0.01）。50、75、100 mmol/L 组与25 mmol/L组相比，差异有统计学意义（q值分别为8.42、10.24、11.31，P＜0.05）；75、100 mmol/L 组与 50 mmol/L 组相比，差异无统计学意义（q值分别为1.82、2.89，P＞0.05）；100 mmol/L组与75 mmol/L组相比，差异无统计学意义（q=1.08，P＞ 0.05）。

25、50、75、100 mmol/L 二甲双胍组 PDCD4 mRNA 相对表达量分别为2.11±0.64、7.22±1.13、11.16±1.23、19.12±3.16，组间表达差异有统计学意义（F=96.26，P＜0.05）。25 mmol/L组与对照组相比差异无统计学意义（q=1.85，P＞0.05），其余各组均较对照组显著上调（q值分别为13.84、23.72、40.11，P＜0.05 或P＜0.01）。50、75、100 mmol/L 组与25 mmol/L组相比，差异有统计学意义（q值分别为10.55、20.43、36.82，P＜0.01）；75、100 mmol/L 组与 50 mmol/L 组相比，差异有统计学意义（q值分别为9.88、26.27，P＜0.01）；100 mmol/L组与75 mmol/L组相比，差异有统计学意义（q=16.39，P＜0.01）。

3.二甲双胍对HaCaT细胞中PDCD4蛋白表达的影响：25、50、75、100 mmol/L 二甲双胍刺激 HaCaT 细胞 24 h 后，与对照组相比，PDCD4蛋白相对表达量分别为1.22±0.08、2.09±0.20、2.26±0.11、2.37±0.07，组间表达差异有统计学意义（F=75.37，P＜0.05）。25 mmol/L组与对照组相比差异无统计学意义（q=3.00，P＞0.05），其余各组均较对照组显著上调（q值分别为14.99、17.28、18.83，P＜0.01）。50、75、100 mmol/L浓度组与25 mmol/L组相比，差异有统计学意义（q值分别为11.98、14.28、15.83，P＜0.01）；75、100 mmol/L 组与50 mmol/L组相比，差异无统计学意义（q值分别为2.64、2.15，P＞0.05）；100 mmol/L组与75 mmol/L 组相比，差异无统计学意义（q=1.94，P＞0.05）。见图1。

图1 蛋白免疫印迹法检测不同浓度二甲双胍刺激HaCaT细胞24 h PDCD4蛋白的表达 1：对照组；2～ 5：25、50、75、100 mmol/L二甲双胍组

四、讨论

二甲双胍作为临床一线的口服降糖药，在体内主要通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路，抑制下游相关酶的活性来调节糖和脂肪的代谢［8］。目前研究发现［9-11］，二甲双胍可以降低糖尿病患者多种肿瘤的发生率。体外研究［2-5］表明，二甲双胍可以抑制肝癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌等肿瘤细胞的生长与增殖，并能缩小荷瘤裸鼠肿瘤体积［3］，但是二甲双胍的抗肿瘤机制尚不完全清楚。研究发现，二甲双胍可以通过激活MAPK信号通路抑制角质形成细胞增殖［12］。本研究结果显示，二甲双胍在体外能显著抑制HaCaT细胞增殖，其抑制率与二甲双胍浓度呈明显的浓度依赖性。MicroRNA是一类长约22个核苷酸的非编码蛋白质单链RNA，在真核生物体内与其靶mRNA的3′UTR碱基配对，通过抑制mRNA的翻译或直接使其降解，在转录后水平调控基因的表达，在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用［13］。其中miR-21-5p因其在多种肿瘤中的表达上调而被认为是一种致癌基因，而且在角质形成细胞异常增殖性疾病如银屑病中，其皮损microRNA表达谱筛选发现，miR-21-5p表达也显著上调［7］。PDCD4 最早由 Shibahara 等［14］于 1995年在小鼠体内首次发现，并证明其高表达在细胞凋亡中的作用，成为越来越受重视的促凋亡因子。近年来研究认为PDCD4是一种新的抑癌基因［15］，而且miR-21-5p及其下游靶基因PDCD4的异常表达在多种肿瘤细胞的发生、发展、转移中是起着重要作用，如肾癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、胃癌细胞等［16-18］。本研究检测了不同浓度二甲双胍刺激HaCaT细胞24 h后，miR-21-5p及其下游靶基因PDCD4的表达变化，发现50～100 mmol/L二甲双胍刺激下，miR-21-5p的表达水平显著下调，而PDCD4的表达水平显著上调。由此推测二甲双胍可能通过下调HaCaT细胞中miR-21-5p的表达，使其下游靶基因PDCD4表达上调，从而发挥抑制细胞增殖的作用。

综上所述，二甲双胍在体外能够抑制HaCaT细胞的增殖，可能与调控细胞中miR-21-5p及PDCD4的表达有关。本研究为二甲双胍在临床上治疗角质形成细胞异常增殖性疾病提供了理论依据。

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2014-06-10）

（本文编辑：颜艳）

Effect of metformin on the proliferation of and expressions of miR-21-5p and PDCD4 in HaCaT human keratinocytes

Jiang Meng,Ma Weiyuan,Sun Qing.Department of Dermatology,Qilu Hospital of Shandong University,Jinan 250012,China

Sun Qing,Email:sunqing7226@163.com

ObjectiveTo evaluate the effect of metformin on the proliferation of keratinocytes,and to investigate its possible mechanism.MethodsHaCaT human keratinocytes were divided into several groups to remain untreated（control group）or be treated with different concentrations（25,50,75,100 mmol/L）of metformin for 24 hours（intervention groups）.Subsequently,CCK8 assay was conducted to evaluate the proliferation of HaCaT cells,real-time quantitative PCR to measure the mRNA expressions of miR-21-5p and its downstream target gene PDCD4,and Western blot to detect the expression of PDCD4 protein in HaCaT cells.Statistical analysis was done by using one-way analysis of variance for multiple group comparisons and SNK-q test for paired comparisons.ResultsAfter 24-hour treatment,the proliferation of HaCaT cells was inhibited by（5.43±3.67）%,（19.61±6.95）%,（45.93±9.56）%and（61.91±6.93）%by metformin of 25,50,75 and 100 mmol/L,respectively,with significant differences observed in cell proliferation inhibition rates among these intervention groups （F=246.90,P＜0.05）.Cellular proliferative activity was similar between the control cells（0.00±3.00%）and those treated with 25 mmol/L metformin,but significantly higher in the control cells than in the other 3 metformin-treated groups （allP＜0.05）,and significantly different between the 4 metformin-treated groups（allP＜0.05）.The relative mRNA expression level（2－△△Ct）of miR-21-5p was 0.90±0.11,0.33±0.05,0.21±0.07 and 0.14±0.04（F=36.99，P＜0.01）,while that of PDCD4 was 2.11±0.64,7.22±1.13,11.16±1.23 and 19.12±3.16（F=96.26,P＜0.05）,and the expression level of PDCD4 protein was 1.22±0.08,2.09±0.20,2.26±0.11 and 2.37±0.07（F=75.37,P＜0.05）,respectively,in HaCaT cells treated with metformin of 25,50,75 and 100 mmol/L.Similarly,no significant difference was observed between the control cells and those treated with 25 mmol/L metformin in the expression level of miR-21-5p mRNA,PDCD4 mRNA or protein,but decreased expression of miR-21-5p mRNA and increased expression of PDCD4 mRNA and protein were noted in cells treated with the other 3 concentrations of metformin compared with the control cells（allP＜0.05）,and significant differences were also found in the expression levels of miR-21-5p mRNA as well as PDCD4 mRNA and protein among the 4 intervention groups（allP＜0.05）.Conclusion Metformin can markedly inhibit the proliferation of HaCaT cellsin vitro,likely by downregulating miR-21-5p expression and upregulating PDCD4 expression.

Keratinocytes;Metformin;Psoriasis;Cell proliferation;miR-21-5p;PDCD4;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.017

国家自然科学基金（81071291、81402607）；山东省自然科学基金（Y2007C003）

250012济南，山东大学齐鲁医院皮肤科

孙青，Email：sunqing7226@163.com