阿维A联合克拉霉素对裸鼠移植瘤生长及肿瘤血管生成的影响

赵雁 叶郁红 吴丽贤 方芳 程波

阿维A联合克拉霉素对裸鼠移植瘤生长及肿瘤血管生成的影响

赵雁 叶郁红 吴丽贤 方芳 程波

目的 观察阿维A联合克拉霉素对人口腔表皮样癌裸鼠移植瘤生长的影响，探讨药物对肿瘤抑制的作用机制。方法 用人口腔表皮样癌细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型。采用随机双盲设计，将31只裸鼠随机分6组，对照组、安慰剂组、阿维A组、克拉霉素组、阿维A+安慰剂组、阿维A+克拉霉素组。对照组6只，余各组均为5只裸鼠。各组治疗3周后测量移植瘤体积和重量，用RT-PCR检测血管内皮生长因子（VEGF）和核转录因子κB（NF-κB）mRNA的表达。对移植瘤体进行病理学分析，采用免疫组化染色检测各组肿瘤中VEGF、细胞增殖指数Ki-67的表达及其微血管密度（MVD）。采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料的均数比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验。结果 阿维A+克拉霉素组瘤体体积、瘤体重量均低于其他5组，差异有统计学意义（均P<0.05）。实时荧光定量PCR检测，阿维A+克拉霉素组VEGF、NF-κB mRNA的表达均低于对照组、克拉霉素组、阿维A组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。免疫组化检测，与对照组、克拉霉素组、阿维A组相比，阿维A+克拉霉素组VEGF表达率均下调（均P<0.01），着色浅；MVD显著降低（均P<0.01），微血管分布较稀疏；Ki-67阳性指数均降低（均P<0.05），肿瘤细胞增殖减少。结论 阿维A联合克拉霉素能协同抑制人口腔表皮样癌裸鼠移植瘤的生长，并下调VEGF表达，抑制血管生成和肿瘤增殖。

异种移植模型抗肿瘤试验；阿维A；克拉霉素；癌，鳞状细胞；血管内皮生长因子类；NF-κB；Ki-67

我们在临床中偶然应用阿维A联合克拉霉素配合CO2激光治愈1例女性面部鳞状细胞癌患者［1］。为进一步研究它们的抗肿瘤机制，我们建立了人口腔表皮样癌裸鼠移植瘤模型，应用阿维A和克拉霉素进行干预，观察瘤体体积、重量、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、核转录因子κB（NF-κB）的表达及各组移植瘤体病理变化，免疫组化检测VEGF表达率、细胞增殖指数Ki-67、微血管密度（microvessel density，MVD）的差异。

一、材料

人口腔表皮样癌细胞株（福建医科大学新药物研究所赠送），RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（美国Gibco公司），胰蛋白酶（美国Amresco公司），Trizol RNA提取试剂（美国Invitrogen公司），阿维A胶囊（重庆华邦制药有限公司），克拉霉素（江苏恒瑞公司），RT-PCR引物（上海铂尚生物技术服务有限公司合成）。无特定病原体（SPF）级饲养裸鼠，雌性，4～5周龄，体重16～18 g，购于福建医科大学动物实验室（动物检疫合格证号：201200056005）。鼠抗人CD34免疫组化单克隆抗体、兔抗鼠VEGF多克隆抗体为福州迈新生物技术开发有限公司产品，鼠抗人Ki-67单克隆抗体为北京中杉金桥公司产品。

二、方法

1.细胞培养：人口腔表皮样癌KB肿瘤细胞生长于RPMI 1640培养基中，培养液含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/L链霉素，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱常规培养。贴壁生长细胞以0.25%胰酶消化传代。

2.人口腔表皮样癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分组：裸鼠饲养于恒温［（25±2）℃］、恒湿（45%～50%）、超净化生物层流架环境内，定期紫外线消毒，饮水经高压蒸汽灭菌，实验操作都在无菌环境下进行。将培养基中人口腔表皮样癌细胞经胰蛋白酶消化后，调整至1×108/L，在裸鼠背部接种0.2ml，无菌饲养2周，瘤体生长至1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm后开始治疗。按临床实验随机双盲标准，加入安慰剂，实验员不知治疗药物。裸鼠按随机数字表法分为6组，对照组、安慰剂组、阿维A组、克拉霉素组、阿维A+安慰剂组、阿维A+克拉霉素组。对照组6只，余各组均为5只裸鼠。将阿维A、克拉霉素及面粉分别溶解于生理氯化钠溶液，涡旋混匀，分别以灌胃器经口将药直接灌入各组裸鼠胃中，以患者临床治疗剂量换算为裸鼠治疗剂量，克拉霉素100 mg·kg-1·d-1，阿维A 7.2 mg·kg-1·d-1，安慰剂为面粉，除对照组外，各组每天给药1次。3周后处死裸鼠，测量瘤块体积和重量。

3.实时定量PCR检测瘤体中VEGF及NF-κB mRNA的表达：取20 mg新鲜瘤体，加入Trizol后匀浆，按Invitrogen Trizol说明书提取RNA，随后反转录成cDNA，稀释后进行定量PCR检测。引物序列：VEGF 正向 5′-CATTGGAGCCTTGCCTTG-3′，反向5′-TTCGTGGGGTTTCTGGTCT-3′，产物大小 90 bp；NF-κB 正向 5′-CCGCACCTCCACTCCATCC-3′，反向 5′-ACATCAGCACCCAAGGACACC-3′，产物大小121 bp；内参引物GAPDH正向5′-CCGTCTAGAAA AACCTGCC-3′，反向 5′-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3′，产物大小217 bp。实时定量PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s共40个循环，60～95℃以5℃为梯度采集熔解曲线。每个实验重复3次。

4.免疫组化检测移植瘤中VEGF、Ki-67的表达及其MVD：将人口腔表皮样癌移植瘤块以4%多聚甲醛固定，常规病理切片检查，免疫组化EnVision法染色。主要步骤：①切片经脱蜡、水化；②预处理组织切片，热修复（CD34染色前需用10 mmol/L pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液高压加热抗原修复）；③滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10min；④加一抗室温孵育30min，分别加鼠抗人单克隆VEGF（1∶100）、CD34（1 ∶100）、Ki-67（1 ∶100）；⑤加 EnVision 二抗室温孵育30min。二氨基联苯胺（DAB）显色，显微镜下观察显色。用已知VEGF、Ki-67阳性乳腺癌和CD34阳性扁桃体组织切片作为阳性对照。光镜下（×200）观察，VEGF阳性细胞为肿瘤细胞胞质内棕黄色颗粒，Ki-67阳性部位为细胞核内棕黄色，每张切片计数5个视野，观察不少于1 000个细胞，分别计算VEGF与Ki-67阳性细胞百分比。CD34阳性为棕色血管内皮细胞，光镜下（×200）计数10个区域，计数每个区域内血管数，取平均数作为该组瘤块的MVD。

5.统计学方法：采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料的均数比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

三、结果

1.各组裸鼠皮下移植瘤体的体积、重量的比较：裸鼠喂药3周后处死。各组动物至实验结束时无死亡，均全部进入指标检测。测量体重；剥离瘤体称重和体积测量，结果见表1。治疗后各组移植瘤体积、重量比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。组间两两比较，阿维A+克拉霉素组瘤体体积、瘤体重量均低于其他各组（均P＜0.05）；阿维A组与克拉霉素组分别与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组裸鼠体重总体比较差异无统计学意义。

表1 裸鼠移植瘤各组经治疗后移植瘤体积、重量及裸鼠体重比较（±s）

表1 裸鼠移植瘤各组经治疗后移植瘤体积、重量及裸鼠体重比较（±s）

组别 只数 瘤体体积（mm3） 瘤体重量（g） 裸鼠体重（g）对照组 6 1750.10±156.76 1.48±0.13 21.64±1.67安慰剂组 5 1745.92±192.21 1.72±0.24 23.09±1.96克拉霉素组 5 1822.34±334.31 1.64±0.47 22.81±0.83阿维A组 5 1470.92±143.65 1.40±0.09 22.18±1.32阿维A+安慰剂组 5 1621.34±195.64 1.45±0.10 22.01±0.36阿维A+克拉霉素组 5 1185.10±177.71 1.12±0.16 21.97±0.76 F值 4.66 3.19 0.52 P值 0.04 0.02 0.76

2.实时荧光定量PCR检测瘤体中VEGF、NF-κB mRNA的表达：治疗后对照组、克拉霉素组、阿维A组、阿维A+克拉霉素组瘤体中VEGF、NF-κB mRNA的表达比较差异有统计学意义（F=6.53、6.10，均P＜0.05）。组间两两比较，阿维A+克拉霉素组VEGF、NF-κB mRNA的表达均低于其他各组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；阿维A组与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；克拉霉素组与对照组比较，VEGF mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05），而NF-κB mRNA的表达明显高于对照组（P＜0.05）。见图1。

3.移植瘤体的组织学及免疫组化观察：组织切片HE染色（图2），阿维A+克拉霉素组瘤组织排列疏松，瘤细胞分裂较少，胞质丰富，组织中可见到蛋白物质及细胞碎片。其他各组癌巢体积较大，瘤细胞形态不规则，核质较大，病理性核分裂较多。克拉霉素组见较多单核细胞。

免疫组化结果显示（表2），对照组、克拉霉素组、阿维A组、阿维A+克拉霉素组裸鼠瘤体VEGF、MVD、Ki-67表达比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与其他3组比较，阿维A+克拉霉素组VEGF表达率降低（均P＜0.01），着色浅；MVD显著降低（均P＜0.01），微血管分布较稀疏；Ki-67阳性指数均低于其他3组（均P＜0.05），肿瘤细胞增殖减少。阿维A组与对照组比较，VEGF、MVD和Ki-67均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；克拉霉素组与对照组比较，VEGF、MVD和Ki-67的差异均无统计学意义。

图1 裸鼠移植瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）和核转录因子 κB（NF-κB）mRNA 相对表达量

表2 裸鼠移植瘤瘤体血管内皮生长因子（VEGF）、微血管密度（MVD）、Ki-67表达（%，±s）

表2 裸鼠移植瘤瘤体血管内皮生长因子（VEGF）、微血管密度（MVD）、Ki-67表达（%，±s）

组别 只数 VEGF MVD Ki-67对照组 5 78.21±2.83 6.40±1.14 82.34±2.35克拉霉素组 5 81.45±3.57 5.80±0.84 78.43±3.07阿维A组 5 69.77±2.58 4.40±0.55 64.56±2.45阿维A+克拉霉素组 5 53.64±3.04 2.00±0.71 48.72±3.46 F值 20.32 27.31 28.49 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

四、讨论

研究发现，干预肿瘤组织中已有和（或）正在形成的血管，阻断血管生成的通路，能够有效抑制肿瘤生长和增殖，使其处于休眠状态［2］。有研究表明，抑制移植瘤中VEGF的表达即血管生成，可抑制肿瘤的生长［3］。有研究表明，NF-κB与鳞状细胞癌、黑素瘤、结肠癌的转移有关［4］，还在抗细胞凋亡中起着重要作用［5］。抑制NF-κB、VEGF靶向治疗的新型药物与恶性肿瘤治疗策略是目前研究热点［3，6］。

体外实验［7-8］表明，阿维A能抑制鳞癌细胞的增殖，促进鳞癌细胞的凋亡。温炬等［9］的研究显示，银屑病患者经阿维A治疗后，皮损的MVD值、VEGF蛋白的表达及血清中VEGF水平较治疗前明显减低。Mikasa等［10］应用克拉霉素治疗非小细胞肺癌。Yatsunami等［11］研究表明，罗红霉素和克拉霉素有抑制小鼠B16BL6黑素细胞瘤生长的作用。肿瘤组织中的MVD是间接测量肿瘤血管生成的指标之一，它与多种肿瘤的临床分期、病理分级以及预后有关［12］。

人口腔表皮样癌裸鼠移植瘤具有恶性肿瘤原位移植的特点，接近恶性实体肿瘤的组织学特征，可以更好地模拟临床恶性肿瘤发生、发展和治疗的过程。临床中我们观察到阿维A联合克拉霉素对皮肤实体恶性肿瘤有抑制作用，但无法证实两者的协同作用。我们在裸鼠体内进一步研究阿维A联合克拉霉素药物抗肿瘤作用机制。结果表明，阿维A联合克拉霉素组VEGF、MVD、Ki-67表达都明显低于对照和单独用药组。移植瘤瘤体体积、重量、实时荧光定量PCR检测的VEGF、NF-κB mRNA表达结果与免疫组化显示的血管生成、组织增殖表达结果基本一致，表明阿维A联合克拉霉素对人口腔表皮样癌移植瘤比单独用药和对照组有明显的抑制作用，并且可以下调VEGF和NF-κB的表达，抑制血管生成。与对照组比较，阿维A组免疫组化检测VEGF、MVD、Ki-67表达均明显降低，但瘤体体积、重量及VEGF、NF-κB mRNA的表达差异无统计学意义，说明阿维A抗肿瘤血管生成作用先于瘤体重量、体积等指标出现。阿维A联合克拉霉素组所有观察指标均低于阿维A组，证实两者联合用药有抗肿瘤的协同作用。

本实验中，我们观察到阿维A与克拉霉素的联合应用增强了药物抗血管增生的作用，抑制了血管因子水平和肿瘤生长。我们从临床逆向实验室研究，可以验证临床观察到阿维A联合克拉霉素联合应用后，肿瘤体积缩小。但这只是实验研究的初步探讨，还需要深入的后续研究。

图2 各组裸鼠移植瘤组织病理学观察（HE×200） 阿维A+克拉霉素组瘤组织排列疏松，瘤细胞分裂较少，胞质丰富，组织中可见到蛋白物质及细胞碎片。其他各组肿瘤癌巢体积较大，瘤细胞形态不规则，核质较大，病理性核分裂较多。克拉霉素组见较多单核细胞

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2014-05-06）

（本文编辑：周良佳 颜艳）

Effects of acitretin combined with clarithromycin on tumor growth and angiogenesis in human oral epidermoid carcinoma xenografts in nude mice

Zhao Yan*，Ye Yuhong,Wu Lixian,Fang Fang,Cheng Bo.*First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fujian Provincial Institute of Dermatology，Fuzhou 350009，China

Cheng Bo,Email:chengbofj@gmail.com

ObjectiveTo evaluate the effects of acitretin combined with clarithromycin on tumor growth in human oral epidermoid carcinoma xenografts in nude mice,and to investigate their antitumor mechanisms.MethodsA cell line of human oral epidermoid carcinoma was subcutaneously inoculated into 31 Balb/c nude mice to establish a xenograft model of human skin tumor.Then,the nude mice were randomly classified into 6 groups according to a double blind protocol:control group（n=6）remaining untreated,placebo group（n=5）treated with wheat flour,acitretin group（n=5）treated with acitretin 7.2 mg/kg per day,clarithromycin group（n=5）treated with clarithromycin 100 mg/kg per day,acitretin+placebo group （n=5）treated with both acitretin （7.2 mg/kg per day）and wheat flour,and acitretin+clarithromycin group （n=5）treated with acitretin （7.2 mg/kg per day）and clarithromycin 100 mg/kg per day.All the drugs were intragastrically administrated once daily.After three weeks of treatment,mice were sacrificed and xenografts were removed.Then,the size and weight of xenografts were measured,and pathological analysis was conducted.Real time-PCR was performed to quantify the mRNA expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF）and nuclear factor （NF）-κB,and immunohistochemistry was carried out to observe the expression of VEGF as well as to determine microvessel density（MVD）and Ki-67 proliferation index.By using the software SPSS 19.0,analysis of variance was performed for comparison of measurement data,and least significant difference （LSD）test for paired comparisons.ResultsBoth the size and weight of xenografts in the acitretin+clarithromycin group were significantly lower than those in the other groups （allP<0.05）.Real-time fluorescence-based PCR revealed weaker mRNA expressions of VEGF and NF-κB in the acitretin+clarithromycin group compared with the control group,clarithromycin group and acitretin group （allP<0.05）.As immunohistochemistry showed,the acitretin+clarithromycin group displayed a decrease in the expression rate （allP<0.01）and staining intensity of VEGF,MVD （allP<0.01）with a sparse distribution of microvessels,Ki-67 proliferation index（allP<0.05）and proliferative activity of tumor cells compared with the control group,clarithromycin group and acitretin group.Conclusion Acitretin combined with clarithromycin can synergistically inhibit the growth of human oral epidermoid carcinoma xenografts in nude mice,downregulate VEGF expression,and suppress angiogenesis and tumor proliferation.

Xenograft model antitumor assays;Acitretin;Clarithromycin;Carcinoma,squamous cell;Vascular endothelial growth factors;NF-kappa B;Ki-67

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.016

福建省卫生厅医学创新课题（2011-CXB-11）

350009福州，福建医科大学附属第一医院，福建省皮肤病研究所（赵雁、方芳、程波），病理研究室（叶郁红）；福建医科大学新药物研究所（吴丽贤）

程波，Email：chengbofj@gmail.com