新型稀释液TCM199和EG冻存牛精液效果试验

桑国俊 郭海龙 容维中 王珂 邱忠玉（甘肃省畜牧兽医研究所 744000）

新型稀释液TCM199和EG冻存牛精液效果试验

桑国俊 郭海龙 容维中 王珂 邱忠玉（甘肃省畜牧兽医研究所 744000）

通过对以TCM199为主要稀释剂，以EG为冷冻保护剂的牛细管冻精的活力测定，筛选出了以TCM199、EG为稀释剂和冷冻保护剂的新型牛细管冻精制作配方。测定表明，以TCM199为主要稀释剂、EG为冷冻保护剂时，配方11的活力最高，达到0.55。

TCM199；EG；GL；细管冻精；活力

1 试验目的和要求

近年来的研究表明，在细胞、胚胎冷冻过程中，为了克服低温对胚胎等微小生命的打击，减少或消除细胞和组织间冰晶的形成，必须在培养液中添加一定量的抗冻剂。以前使用的主要是二甲基亚砜（DMSO）或甘油（GL），但是他们均对细胞或胚胎产生了一定的毒副作用，其中DMSO的毒性比GL强，所以现多用GL。乙二醇（EG）是近年发现的一种新型抗冻剂，用EG冷冻时，细胞产生的冰晶更少；同时发现，EG对细胞的毒副作用较小。本试验将利用TCM199作为能量和营养素来源，以EG作为冷冻保护剂，多梯度研究TCM199、EG作为稀释剂和冷冻保护剂保护精子的最优剂量，建立新型牛精液稀释和冷冻保存技术。

2 试验设备和要求

种公牛来自宁县兴旺牧业种牛场和甘肃省畜牧兽医研究所牛场。主要设备有人工采精器械、专用保温箱、吸管、冰箱、冷冻仪等。

3 试验方法和步骤

稀释液：按照设计配方、用量进行配制。冷冻液：第一液为低浓度冷冻液，用于牛精液采集后的第一次稀释；第二液为高浓度冷冻液，用于第二次平衡稀释。TCM199按照其说明浓度配制，并用酚红和NaOH进行pH标定。EG按照设计添加。

本试验针对以下3种处理实施，即测定不含冷冻保护剂时的精子冻存效果、添加TCM199但不含冷冻保护剂的精子冻存效果、以TCM199和EG为冷冻保护剂时的精子冻存效果。每个水平测定10次（重复），每次制作100枚细管冻精，从中随即抽检10枚，每次抽检测定均在制冻后24h进行。用Spss统计分析。

4 试验结果

4.1 不含冷冻保护剂时的精子冻存效果

4.1.1 配方组合

系列配方中设计缺失TCM199、EG，仅仅用常规能量、抗生素构成稀释液，并进行冷冻保存和解冻测定，评定和掌握牛精液的保存和抗冷冻打击的特性。各组合配方详见表1。

配方中用卵磷脂替代卵黄，添加Tris以图进一步提高稀释液的缓冲能力，给精子提供良好的生存环境。

4.1.2 不含冷冻保护剂的细管冻精解冻效果

按照试验设计设定的时间，对冻存24h后的试验冻精进行解冻。解冻时先准备好30℃水浴，将细管冻精在水浴中搅动2～3s解冻，用细管剪剪掉细管两端封口，分别在安排时段提取该管解冻精液抹片观察和记录，观察温度为25℃。

每组配方测定10枚细管冻精。解冻效果统计详见表2。

测定结果表明：

（1）在不添加冷冻保护剂和稀释剂，但添加果糖等基础营养素的情况下，用超纯水稀释冷冻的牛精液也保持了适度的解冻活力。效果最好的为8号配方，在18h时的活力仍然维持在0.3的水平。

（2）在不添加其它成分，仅仅用超纯水稀释的情况下，解冻冻精也有较高的活力，并且维持了较长时间。如10号配方，刚解冻后的活力有0.45，只是有效活力维持时间短。

（3）活力衰减速率不一致。各组在0～6h期间的活力下降最快，6～30h期间活力缓慢下降，30～48h期间的活力平稳下降。

表1 不含冷冻保护剂的配方组合

表2 不含冷冻保护剂的时冻存冻精的解冻效果

4.2 添加TCM1.9但不含冷冻保护剂的细管冻精解冻效果

本项试验中，稀释液仅仅添加了不同剂量的TCM199，未添加EG，以便更好地掌握TCM199在牛精液冷冻保存过程中的效果。各组配方和效果测定分述如下。

4.2.1 配方组合

添加TCM199但不含冷冻保护剂组的配方详见表3。在测定不同浓度TCM199的同时，在平行配方中还添加了Tris、柠檬酸钠、卵磷脂等。其中1、2、3、4、7号添加了Tris，5、6、8号添加了柠檬酸钠，9号添加了卵磷脂。

4.2.2 细管冻精解冻效果

添加TCM199但不含冷冻保护剂组的解冻效果详见表4。

测定结果表明：

（1）在只添加TCM199而未添加冷冻保护剂的情况下，冷冻解冻精液也保持了一定的活力。效果最好的为1号和5号配方，在18h时的活力仍然维持在0.2～0.3的水平。其它各组合在刚解冻时活力还较高，但持续时间短，活力下降速度快。

（2）活力下降高峰期出现在0～6h阶段。各组下降速度基本一致，在图2中显示出相似的斜率。在6～24h阶段，各组合活力的下降速度趋缓，但在24～30h阶段又出现了活力迅速下降的现象，此后精子开始显著衰竭、残缺和死亡，失去了受精能力。

4.3 以TCM1.9和EG为稀释剂和冷冻保护剂时的精子冻存效果

4.3.1 配方组合

本组试验了以TCM199稀释剂和以EG为冷冻保护进行的牛精液冷冻效果试验。目的是探讨TCM199和EG相互作用于精液的效果，其配方详见表5。本项试验中，在测定不同浓度TCM199、EG的同时，在平行配方中还添加了卵磷脂、Tris、柠檬酸钠及果糖。

表3 添加TCM199但不含冷冻保护剂组的配方

表4 添加TCM199但不含冷冻保护剂组活力测定统计

表5 TCM199+EG的配方组合

4.3.2 细管冻精解冻效果

细管冻精的冻存和解冻及测定方法同GL组。解冻效果详见表6。

表6 TCM199+EG的配方组合活力测定统计

测定结果表明：

（1）不同浓度TCM199+EG组的冻精解冻活力不同。0～12h阶段的活力以2、9、11号组高于其它组（p＜0.01），同时，1、4号活力最低。

（2）活力衰减速率不一致。活力衰减分为比较明显的3个阶段，其中0～6h为第一阶段，其特点是活力下降速度快；6～24h为第二阶段，各组的活力均缓慢下降；24～48h为第三阶段，活力进一步下降到消失。在这3个起伏阶段中，与TCM199+GL试验相似，依然是单纯由TCM199+GL的组如11号的活力好于其它组，其次是未添加柠檬酸钠的组，活力比较低的是既添加柠檬酸钠又添加果糖的试验组。但与TCM199+GL试验相比，TCM199+EG的各组试验的活力相对较低。2号配方中添加了卵磷脂，活力也较高。

5 结果与分析

通过本次对TCM199、EG组及其对比试验表明，在不添加TCM199、EG、的情况下，虽然牛精液冷冻解冻后保持了一定的活力，但活力维持时间很短，镜像观察中存在大量畸形精子，表现为断尾、粘连、顶体缺失、侧行和逆行，不具备应用价值。其它三组试验中，总体活力以TCM199+EG系列最好，纯TCM199系列次之。

（1）未添加试验成分的牛精液的冷冻解冻效果。本试验的基础液为果糖和超纯水，部分组合中添加了柠檬酸钠、Tris或卵磷脂，但未添加EG抗冻剂。其冷冻精液解冻后也表现出了一定的活力，特别是刚解冻后的活力比较高，但在解冻后活力迅速下降，畸形精子迅速增多，可判断为该类精子的受精能力低下，不能用于生产性配种繁育。同时也说明牛精液自身具备良好的抗低温打击能力。

（2）以TCM199为主的牛精液冷冻解冻效果。本试验是在基础液果糖和超纯水的基础上，加入了TCM199，同时也在部分组合中添加了柠檬酸钠、Tris或卵磷脂，但未添加EG。其冷冻精液解冻后的表现与未添加TCM199和EG组相似，也表现出了一定的活力，特别是刚解冻后的活力比较高，但在解冻后活力迅速下降，随着时间延长，畸形精子不断增多。效果最好的为1号和5号配方，在18h时的活力仍然维持在0.2～0.3的水平。

（3）以TCM199+EG为主的牛精液冷冻解冻效果。本试验是在基础液果糖和超纯水的基础上，加入了TCM199和EG，同时也在部分组合中添加了柠檬酸钠、Tris或卵磷脂。其冷冻精液解冻活力明显高于未添加TCM199和EG组和仅添加TCM199的组。测定表明，该组2、9、11号的活力最好。

（4）综合分析。通过对3种不同处理及其多样本资源的测定与分析，表明牛精液的处理方法不同，其冻精解冻活力不同。空白处理和仅添加TCM199的处理测定说明了精子本身具有良好的抗低温打击能力，解冻活力较好，但维持时间很短，活力丧失速度快，精子品种不佳，不具备受精能力。TCM199+EG组的解冻冻精的质量较高，其解冻精子的活力维持时间较长，精子品质较高。推荐配方为TCM199+EG组的配方11。

（5）小结。上述试验结果表明，TCM199、EG对牛精子均有良好的冷冻保护能力；其它营养成分的变化对EG和GL保护精子的效果有一定影响，特别是卵黄的作用在营养组份中的作用比较明显。

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目“EG和TCM199提高牛精液冷冻效果的关键技术研究”。

桑国俊（1963-），男，甘肃省临洮县人，研究员，博士研究生，主要研究方向为动物遗传育种与繁殖。