锌修饰硅酸钙生物陶瓷涂层的体外生物相容性研究

徐立璋 余将明 李 恺 郑学斌 邓国英 王伟恒 黄晓东 叶晓健

锌修饰硅酸钙生物陶瓷涂层的体外生物相容性研究

徐立璋 余将明 李 恺 郑学斌 邓国英 王伟恒 黄晓东 叶晓健

目的研究锌修饰硅酸钙生物陶瓷涂层的体外生物相容性，为该涂层临床应用的可行性提供实验依据。方法检测该涂层的物理表征；检测该涂层浸提液的离子浓度；用不同稀释比例的浸提液培养MC3T3-E1细胞，观察细胞形态，MTT法检测细胞相对增殖率，并检测细胞凋亡水平；测定溶血率。结果该涂层浸泡72 h后，浸提液中钙、硅、锌离子浓度均明显升高；用不同稀释比例的浸提液培养的MC3T3-E1细胞都表现出正常的细胞形态，其中3.125%、6.25%组细胞量较多，相对增殖率高于阳性对照组，且细胞凋亡率低于阳性对照组（完全培养基）；随浸提液浓度增加，可对细胞增殖产生轻度抑制作用，凋亡率逐渐升高；溶血试验结果显示，该涂层浸提液的溶血率为0.5%。结论锌修饰硅酸钙生物陶瓷涂层没有细胞毒性、生物相容性好，具有作为骨植入体及其他生物材料表面改性的生物学基础。

锌修饰硅酸钙生物陶瓷涂层细胞毒性凋亡生物相容性骨植入体

为提高植入体与骨组织整合的能力，应用等离子喷涂法对钛基表面进行改性，已成为近年来研究的热点。羟基磷灰石（HA）与人体骨中的无机物结构相同，具有优良的生物活性与生物相容性[1]，已作为骨植入材料在临床广泛应用[2]，但由于HA易降解及结合强度不高，常导致临床长期效果欠佳[3]。

硅酸钙生物陶瓷涂层结合强度高，且生物活性和生物相容性均优于HA[4]，但其化学稳定性欠佳，易降解且浸泡后结合强度明显降低，同时导致pH值上升[5]，对骨细胞存在潜在的损伤，限制了其在生物学方面的应用。为了解决硅酸钙陶瓷材料的化学稳定性差及机械强度低的问题，我们根据阳离子修饰钙硅基生物陶瓷涂层的理念，将Zn离子掺杂到硅酸钙中获得了锌黄长石（Ca2ZnSi2O7），并等离子喷涂于钛合金（Ti-6Al-4V）表面，成功制备了锌修饰硅酸钙生物陶瓷涂层。本实验研究锌修饰硅酸钙生物陶瓷涂层的体外生物相容性，为该涂层临床应用的可行性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

MC3T3-E1细胞株（中科院上海细胞生物学研究所）；α-MEM培养基，胎牛血清（GIBCO，美国）；MTT试剂，Triton X-100，二甲基亚砜（SIGMA，美国）；FITC Annexin V凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen，美国）。

电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICPAES，瓦里安710-ES，英国）；场发射电子显微镜（SEM，Hitachi S-4800，日本）；X-射线衍射仪（XRD，RigakuCo，日本）；酶联免疫测定仪（MK3，美国）；流式细胞分析仪（BECKMAN COULTER，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 涂层材料的制备

选用Ti-6Al-4V方片状材料作为基底材料，基材根据特定参数，采用大气等离子喷涂系统（APS）进行等离子喷涂，获得10 mm×10 mm×1.5 mm、喷涂厚度为170 μm的锌修饰硅酸钙生物陶瓷涂层材料（材料制作由中国科学院上海硅酸盐研究所完成）。

1.2.2 涂层物理表征检测

扫描电镜观测表面形貌，XRD分析原始粉末及涂层成份，结合强度测试检测涂层与钛基的结合强度。

1.2.3 材料的预处理及浸提液的制备

以丙酮、75%乙醇、去离子水各超声清洗15 min，经干燥箱干燥后，高温高压灭菌备用。用α-MEM培养基在37℃、5%CO2环境下，按材料表面积/溶液量（cm2/mL）=2.0（ISO标准：0.5~6.0 cm2/mL）的比例，对涂层进行浸提，72 h后，收集浸提液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，备细胞试验用。使用电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICPAES）检测浸提液离子浓度。以α-MEM培养基为稀释液，将浸提液按照100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%的比例进行逐步稀释，作为实验组培养液。

1.2.4 细胞培养

实验选择MCET3-E1细胞，以含10%FBS的 α-MEM培养液，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下的恒温培养箱内培养，细胞融合至80%~90%时消化传代，以完全培养基重悬，制成1×104cells/mL的细胞悬液。以每孔200 μL种植于96孔板中，培养24 h及48 h后用于细胞毒性检测；以每孔2 mL种植于6孔板中，培养24 h后用于细胞形态学观察及细胞凋亡率检测。

1.2.5 浸提液培养细胞

细胞培养24 h后移除培养基，96孔板中加入100 μL浸提液作为实验组；加入100 μL完全培养基作为阳性对照组（Ctr+）；在完全培养基中加入50 μL的0.2%Triton X-100作为阴性对照组（Ctr-）；单纯100 μL培养基作为空白对照组组。6孔板中加入2 mL浸提液作为实验组；加入2 mL完全培养基作为阳性对照组（Ctr+）；在完全培养基中加入1 mL的0.2%Triton X-100作为阴性对照组（Ctr-）。

1.2.6 细胞形态学观察

倒置光学显微镜观察MC3T3-E1细胞在该涂层浸提液的各比例稀释液中培养24 h后的黏附及伸展情况。

1.2.7 细胞毒性检测

细胞培养24 h及48 h后，采用MTT法检测吸光度值。即到各时间点后每孔加入20 μL的MTT试剂，反应4 h后移除上清，每孔加入100 μL DMSO，反应10 min后置入酶标仪中，在490 nm波长下检测吸光度，每个标本重复6次。计算细胞存活率（VB）。VB=（实验组-空白组）/（阴性组-空白组）×100%

1.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡率

每组设3个复孔，浸提液培养24 h，消化后收集细胞，用预冷的结合缓冲液洗涤2次，4℃下以1 000 r/min离心5 min；用结合缓冲液调整细胞密度至1.0×106cells/mL，取100 μL细胞悬液置于1.5 mL EP管中，加入标记有异硫氰酸荧光素（FITC）的磷酯酰丝氨酸结合蛋白V（Annexin V）5 μL和碘化丙啶（PI）5 μL，混匀，室温下避光孵育15 min，经流式细胞仪分析，根据AV-FITC/PI染色情况，确定早期凋亡、晚期凋亡、坏死或正常细胞，计算细胞早、晚期凋亡率。

1.2.9 溶血试验

按GB-T16175-2008《医用有机硅材料生物学评价实验方法》第13部分《溶血试验》进行。

实验分为3组：阴性对照组（N组）为0.9%NaCl溶液；Ca2ZnSi2O7涂层组（Z组）加入未稀释浸提液；阳性对照组（P组）为蒸馏水。各组平行操作3个样本。

1.3 统计学分析

所得数据以SPSS 21.0进行单因素ANOVA方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。使用Graphpad Prism 5作为制图软件。

2 结果

2.1 涂层的物理表征

扫描电镜显示，该涂层颗粒较大（约60～120 μm），表面较粗糙，凹凸不平，由融化较好、扁平的层状颗粒堆积而成（图1）。XRD分析显示，原始粉末中主要成份为Ca2ZnSi2O7，含少量的Ca2SiO4与CaSiO3，该原始粉体与电弧等离子体喷涂后涂层的衍射峰位基本吻合，说明在等离子喷涂前后该材料的成份无明显改变（图2）。与钛基的结合强度为（33.4±2.2）MPa。

图1 涂层表面形貌Fig.1The surface morphology of the coating

图2 锌修饰硅酸钙陶瓷原始粉体与涂层的XRD图Fig.2XRD of Zinc-modified CaSiO3bioceramic raw powder and the coating

2.2 涂层浸提液的离子浓度

ICPAES检测结果显示，硅酸钙陶瓷涂层及该涂层浸泡72 h后钙、硅离子浓度均明显升高，且前者明显高于后者（P＜0.01），说明锌离子的加入对硅酸钙的降解具有明显的抑制作用。而锌离子浓度只在Ca2ZnSi2O7涂层浸泡后显著升高（P＜0.05）（表1、图3）。

表1 各涂层材料在α-MEM培养液中浸提3d后的离子浓度（Mean±SD，ppm）Table 1Ion concentration in each group after materials soaked for 3 days(Mean±SD,ppm)

图3 各组材料浸泡3 d后Ca、Si、Zn的离子浓度Fig.3Ion concentration of Ca,Si,Zn in each group after materials soaked for 3 days

2.3 细胞形态学观察

倒置光学显微镜观察显示，MC3T3-E1细胞在该涂层各比例稀释浸提液中均能正常贴壁生长，黏附及伸展良好，细胞呈梭形或多角形，呈伸展状态并伸出一些细丝状突起，其中3.125%、6.25%组细胞量较多（图4）。

图4 各组浸提液培养48 h后的细胞形态Fig.4Cell morphology after cultured in each extract group for 48 hours

2.4 细胞毒性检测

该涂层浸提液培养MC3T3-E1细胞24 h、48 h，MTT试验结果显示，3.125%、6.25%浸提液组中细胞的相对增殖率比阳性对照组要高，随着浓度增加，浸提液对细胞有轻度的抑制作用，但即使是100%的浸提液，其细胞存活率也大于80%。根据6级细胞毒性评定标准，其毒性为1级，没有明显的细胞毒性（图5）。

图5 MC3T3-E1细胞在各比例浸提液中培养24 h、48 h后的细胞活性Fig.5The activity of MC3T3-E1 cells after cultured in each proportion of extracts for 24 hours and 48 hours

2.5 细胞凋亡水平检测

3.125 %、6.25%浸提液组培养的细胞凋亡率低于阳性对照组，而其他组高于阳性对照组，且实验组随着浸提液比例增加，早、晚期和总凋亡率逐渐升高，早期凋亡率均高于晚期凋亡率（P＜0.05）（图6）。

图6 浸提液培养24 h后的细胞凋亡率Fig.6Cell apoptosis rates after cultured in each proportion of extracts for 24 hours

2.6 溶血试验

阴性对照组OD值应不大于0.03，阳性对照组OD值应在0.50～1.00范围内，试验具有可信性。

在浸提液溶血试验中，N组和P组平均OD值分别为0.005和0.748，说明结果可信。Z组平均OD值为0.004，溶血率为0.5%，无溶血反应。

3 讨论

在组织工程研究中，生物材料的理化特性直接影响细胞的反应和最终的组织构建[6]。而表面改性技术已被广泛应用于提高金属生物材料的耐磨性、耐腐蚀性和生物相容性的拓展改良方面[7-8]。

硅酸钙具有良好的骨诱导能力[9]。Si离子在促进细胞增殖方面具有重要作用[10-11]。因此，硅酸钙浸提液可以增加成骨细胞的增殖率，并可通过促进碱性磷酸酶的分泌，促进前成骨细胞的成骨分化[12]。但是，该材料生物陶瓷涂层化学稳定性较差，降解较快，溶解率高，且与基体间的结合强度低，限制了其在医学临床的应用。

锌离子是多种酶（如碱性磷酸酶、碳酸酐酶等）的辅助因子，作为骨基质的成份参与骨代谢。多项研究显示，锌能增强骨中成骨细胞的吸附和磷酸酶的活性，促进成骨表达，以及促进前成骨细胞分化、矿化[13-14]。适宜的离子浓度同样可以促进人骨髓间充质干细胞的黏附和增殖，增强其黏连蛋白的表达[15]；同时还能抑制体外破骨细胞的分化及活性，从而抑制骨吸收过程[16]。因此，我们选择锌离子作为阳离子修饰硅酸钙陶瓷涂层的首选。

锌修饰硅酸钙粉体在等离子喷涂前后，其成份无明显改变，说明此材料涂层的制备方法选择恰当。该涂层表面粗糙、多孔的结构，有助于骨组织在其表面的生长，改善植入体与骨组织之间的结合[17]。涂层表面宏观的凹凸样纹同样影响到涂层的受力状态，表面粗糙度有利于将宏观的剪切应力部分转化成局部的正压应力，有利于涂层在应力下的稳定。该涂层浸提液钙、硅离子浓度明显低于硅酸钙涂层，说明其具有更好的化学稳定性。我们由此推断，锌对于钙硅基陶瓷材料的溶解性具有较大的阻碍作用，且该涂层具有一定的抗菌性能[18]。

本实验中，MC3T3-E1细胞在各浸提液稀释液中均贴壁生长良好，MTT试验表明，3.125%和6.25%组的细胞相对增殖率较高，但随浸提液比例升高，对细胞生长有轻度的抑制作用。有研究显示，锌离子浓度约在（1×10-6）～（1×10-4）mol/L时，能促进MC3T3-E1细胞增殖分化[19]。该涂层释放锌离子的浓度约为（1.39±0.12）×10-4mol/L，与此范围接近，且该涂层还可以缓释人体骨代谢必须的钙离子、硅离子。因此，该涂层析出的低浓度离子具有促进前成骨细胞黏附和增殖的作用。低浓度锌离子还具有抑制细胞凋亡的作用[20]，流式细胞检测结果显示，3.125%和6.25%组的细胞凋亡率均低于阳性对照组，和MTT试验结果一致，说明合适的浸提液比例拥有优秀的抗凋亡能力。该涂层溶血率为0.5%，无溶血反应，显示了本涂层材料具有良好的血液相容性。因此，该涂层基本没有细胞毒性，是安全可靠的。

本实验结果表明，该涂层具有化学稳定性好，与钛基结合强度高，毒性低，促细胞黏附生长，抗凋亡等优点，且抗弯强度和断裂韧度强[21]，具有作为骨植入体及其他生物材料表面改性的生物学基础，拥有良好的临床应用前景。

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The Biocompatibility of Zinc-modified CaSiO3Bioceramic Coating in vitro

XU Lizhang1,YU Jiangming1,LI Kai2, ZHENG Xuebin2,DENG Guoying1,WANG Weiheng1,HUANG Xiaodong1,YE Xiaojian1.

1 Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003,China;

2 Shanghai Institute of Ceramics,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200050,China.Corresponding author:YE Xiaojian(E-mail:xjye2012@126.com).

ObjectiveTo study the biocompatibility of zinc-modified CaSiO3bioceramic coating in vitro,and to provide experimental basis of its clinical application.MethodsThe physical characteristic of the coating and the concentration of differentions extracted from the coating were detected.Then the extract was used in MC3T3-E1 cells culture with different concentrations for cellular morphological observation,including the relative growth rate measured by MTT and the apoptosis rates detected by flow cytometry.Hemolysis ratio of the coating was also detected.ResultsCalcium,Silicon,Zinc ion concentrations of the coating's extract were significantly increased after immersion for 72 hours.All cells cultured with different proportions of diluent showed normal cellular morphology.Cells cultured in group 3.125%and 6.25%had larger quantity,higher relative increment rate and lower apoptosis rate,compared to positive control group(complete medium). Alone with the increasing concentrations,mild inhibition to the cells and increasing apoptosis rate were observed.The hemolysis rate of the coating's extract detected by hemolysis test was 0.5%.ConclusionThe Zinc-modified CaSiO3bioceramic coating with non-cytotoxicity and good biocompatibility has the biological basis of surface modification for bone implants and other biological material.

Zinc-modified CaSiO3bioceramic coating;Cytotoxicity;Apoptosis;Biocompatibility;Bone implants

Q813.1+2

A

1673－0364（2015）04－0229－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.003

2015年3月23日；

2015年5月12日）

国家自然科学基金项目（81472071）；863计划（2013AA032203）。

200003上海市第二军医大学附属长征医院骨科（徐立璋，余将明，邓国英，王伟恒，黄晓东，叶晓健）；200050上海市中国科学院上海硅酸盐研究所（李恺，郑学斌）。

叶晓健（E-mail：xjye2012@126.com）。