双波长RP-HPLC法同时测定黄连上清片中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的含量

彭程，师永清

（西北民族大学，甘肃 兰州730030）

双波长RP-HPLC法同时测定黄连上清片中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的含量

彭程，师永清

（西北民族大学，甘肃 兰州730030）

目的形成同时测定黄连上清片中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素含量的方法。方法在以下条件下采用双波长RP-HPLC法测定黄连上清片中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的含量：色谱柱为HiborC18（4.6 mm×150 mm，5μm），流动相为乙腈-0.2%的磷酸水溶液，梯度洗脱，流速0.9mL·min-1；检测波长分别为238 nm（栀子苷）和275 nm（大黄素、盐酸小檗碱、黄芩苷）；柱温为25℃。结果栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素线性范围分别为0.031 1～0.622 2μg（r= 0.999 65），0.080 0～1.600 0μg（r=0.999 5），0.115 6～1.155 6μg（r=0.999 45），0.020 0～0.400 0μg（r=0.998 1）；平均加样回收率分别为101.5%、101.0%、104.5%、101.3%；RSD分别为2.1%、3.1%、1.6%、2.6%。结论该方法操作方便，结果准确，精密度高，重现性好，适用于同时测定黄连上清片中栀子苷、黄芩苷、大黄素和盐酸小檗碱的含量。

RP-HPLC；黄连上清片；含量测定

黄连上清片由黄连、黄芩、栀子、大黄、连翘、薄荷、旋覆花、荆芥穗、防风、石膏、桔梗、黄柏、蔓荆子（炒）、白芷、甘草、川芎和菊花17味药材组成［1-2］，主要用于治疗头晕目眩、牙齿疼痛、口腔溃疡、咽喉疼痛、耳痛耳鸣、大便干燥、小便赤短等。单独测定栀子苷、黄芩苷、大黄素、盐酸小檗碱含量方法的文献报道较多［3-8］，但同时测定栀子苷、黄芩苷、大黄素、盐酸小檗碱含量的未见文献报道。本实验采用双波长RP-HPLC同时测定栀子苷、黄芩苷、大黄素、盐酸小檗碱的含量，方法简便，分离度好，结果准确，能够为黄连上清片的产品质量分析提供理论依据。

1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Hibor C18键合硅胶色谱柱（4.6mm×150 mm，5μm）；DL-720D数控超声波清洗器（上海文信仪器有限公司）；DFT-200高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；AL204-2C型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

乙腈（色谱纯，天津市光复精细化工研究所），甲醇（分析纯，天津市光复精细化工研究所），磷酸（分析纯，烟台市双双化工有限公司），水为重蒸馏水。栀子苷对照品（批号：110749-200410，供含量测定），黄芩苷对照品（批号：110715-201016，供含量测定），盐酸小檗碱对照品（批号：110731-200609，供含量测定），大黄素对照品（批号：110756-200110，供含量测定），以上均购自中国药品生物制品检定所。黄连上清片为市售品，批号分别为121007、20120717、1207150。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Hibor C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相为乙腈（B）-0.2%磷酸水溶液（A）；梯度洗脱程序为0.00～10.00分钟，18%A→30%A；10.00～12.00分钟，30%A→20%A；12.00～14.00分钟，20%A→16%A；14.00～20.00分钟，16%A→28%A；20.00～30.00分钟，28%A→65%A；30.00～40.00分钟，65%A→80%A。检测波长分别为238 nm（栀子苷），275 nm（盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素）；进样量：20μL；柱温：25℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取减压干燥至恒重的栀子苷、黄芩苷、大黄素、盐酸小檗碱对照品3.5 mg、9.0 mg、4.5 mg、2.0 mg，分别置于体积为25 mL的容量瓶中，用甲醇超声溶解（功率240 W，频率45 Hz），放冷至室温，定容至25 mL，得栀子苷0.14 mg·L-1、黄芩苷0.36 mg·L-1、大黄素0.18mg·L-1、盐酸小檗碱0.104mg·L-1对照品储备液。分别精密吸取上述各对照品储备液，按体积比2∶2∶1∶1摇晃均匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，随后可得对照品含量分别为栀子苷0.0467mg·L-1、黄芩苷0.1200mg·L-1、大黄素0.060 0mg·L-1、盐酸小檗碱0.034 67mg·L-1的对照品混合溶液。

2.2.2 样品溶液取黄连上清片20片，除去糖衣，置研钵中研碎，取样品粉末1.0 g，精确称量后放于100mL容量瓶中，用70%甲醇水溶液45 mL超声（功率240W，频率45 Hz）提取两次，将其冷却至室温，用70%甲醇水溶液定容、摇匀、静置，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照样品溶液依照黄连上清片处方组成比例与制备方法，按制备样品溶液的方法分别配制缺栀子、缺黄芩、缺大黄、缺黄连和黄柏的阴性对照品溶液。

2.3 专属性实验

取混合对照品溶液、样品溶液及各缺相应成分的阴性对照样品溶液，按2.1项下的色谱条件对进样进行分析，在所得到的色谱图中，有与混合对照品溶液栀子苷、大黄素、黄芩苷及盐酸小檗碱保留时间相同的特征峰，保留时间分别为6.6分钟、16.5分钟、24.9分钟和36.4分钟，而阴性对照样品溶液中无此特征峰，表明阴性样品对所测组分无干扰；理论板数分别为26 600、16 200、109 500和1 083 300；分离度分别为2.95和3.01，5.70和3.00，2.09和6.01，2.33和2.28；拖尾因子分别为0.97、1.05、0.96和1.02，结果见图1～2。

2.4 标准曲线

精密量取对照品混合溶液1μL、3μL、5μL、7μL、10μL、12μL、15μL、20μL，在2.1项下的色谱条件进行进样分析，以进样量X（μg）为横坐标、峰面积Y为纵坐标，进行线性回归分析，结果栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素回归方程分别为Y=1 223.3X+12.429（r=0.999 65），Y=3 005.3X-39.638（r=0.999 5），Y=1880.2X+21.985（r=0.99945）和Y=3 055.2X+515.84（r=0.998 1）；线性范围分别为0.031 1～0.622 2μg，0.080 0～1.600 0μg， 0.115 6～1.155 6μg，0.020 0～0.400 0μg。

2.5 精密度实验

取对照品混合溶液，按2.1项下色谱条件，自动重复进样5次，进样量5μL，结果栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素峰面积RSD分别为1.60%、1.09%、1.89%、1.58%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

精密称取同一批号黄连上清片（批号：121007）样品6份，按2.2.2项下方法，分别制备样品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样分析，进样量20μL，记录色谱图，计算栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的平均含量，结果栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素平均含量分别为1.28 mg·g-1、0.34 mg·g-1、0.62 mg·g-1、0.25 mg·g-1；RSD分别为1.89%、1.05%、1.94%、1.98%，表明重复性良好。

2.7 稳定性实验

取配制好的同一批号黄连上清片（批号：121007）样品溶液，室温下放置，按2.1项下色谱条件，分别于配制后0、2、4、8、12小时各进样1次，进样量20μL，结果栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素峰面积RSD分别为1.93%、1.45%、1.89%、1.92%，表明样品溶液在12小时内基本稳定。

图1 高效液相色谱图1

图2 高效液相色谱图2

2.8 加样回收实验

取研细的同一批号黄连上清片（批号：121007）6份，每份约0.25 g，精密称定，研细，定量转移至50 mL量瓶中，分别精密加入栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素对照品储备溶液各2.50mL、0.25mL、1.50mL和0.35mL，按2.2.2项下方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样分析，进样量20μL，栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素平均回收率分别为101.5%、101.0%、104.5%、101.3%；RSD分别为2.1%、3.1%、1.6%和2.6%，结果见表1。

表1 加样回收实验（n=6）

2.9 含量测定

分别取3批不同批号黄连上清片样品，每批样品各3份，按2.2.2项下方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样分析，进样量20μL，记录峰面积，分别计算样品中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

实验中分别比较了乙腈、水等不同的流动相系统，并加入磷酸为改性剂。结果发现，以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱进行分离，各成分峰形较好，分离度高。

3.2 检测波长的选择

实验中根据二极管阵列检测器（PAD）上得到的紫外吸收光谱图，选择各被测成分的最大吸收波长，并同时辅助进行成分定性。238 nm处栀子苷有最大吸收，275 nm处大黄素、盐酸小檗碱、黄芩苷有最大吸收。本实验采用双波长法，分别选择4种成分各自最大吸收波长作为检测波长。

3.3 提取方法的选择

实验中比较了60%、70%、80%、90%和100%的甲醇溶液作为溶剂进行超声提取，结果用70%的甲醇水溶液为溶剂，提取效果较好；以70%甲醇为提取溶剂，比较了回流提取法和超声提取法，超声提取法效率较高且提取时间短，超声提取法一般30分钟即可完成。本实验选择以70%甲醇为溶剂，超声提取30分钟的方法。

4 结语

以栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素为定量监控指标，可有效地控制黄连上清片产品的质量。本实验采用双波长RP-HPLC法同时测定黄连上清片中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素含量，操作方便，结果准确，精密度高，重现性好，为更好地控制黄连上清片产品质量提供了科学依据。

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G424.31

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1671-1246（2015）18-0109-03