正交试验优化芹菜素铝配合物的荧光光度法测定条件

彭文毫

（湛江卫生学校，广东 湛江524037）

正交试验优化芹菜素铝配合物的荧光光度法测定条件

彭文毫

（湛江卫生学校，广东 湛江524037）

目的优化芹菜素铝配合物的荧光光度法测定条件。方法在单因素实验的基础上，利用正交试验优化芹菜素铝配合物荧光光度法测定的反应条件。结果芹菜素铝配合物荧光光度法测定条件的最优组合为反应温度25℃、溶液pH值6.5、反应时间10分钟。芹菜素的加入量在2.0×10-5～3.2×10-4mol/L范围内与芹菜素铝配合物的荧光强度（ΔF）线性关系良好（R2=0.996 6）。结论本方法简便、快速，是一种快捷测定芹菜素含量的好方法。

芹菜素；配合物；荧光光度法；正交试验；测定条件

芹菜素（Apigenin）是黄酮类化合物，又称芹黄素、芹菜苷元，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中，尤以芹菜中含量为高，在一些药用植物如车前子、络石藤、水蔓青和毛叶藜芦等中也有很高的含量。芹菜素的化学结构为5，7，4'-三羟基黄酮，为黄色针晶状粉末，不溶于水，易溶于乙醇和二甲基亚砜。研究表明，芹菜素具有抗炎、抗凋亡［1］、抗氧化［2］、抗菌、抗病毒［3］以及调节内分泌［4］等多方面的生物学活性，同时还具有明显的抗肿瘤作用［5-6］。目前测定芹菜素的方法主要有毛细管电泳法［7］、色谱法［8］及质谱分析法［9］等，稀有金属分光光度法［10］也有报道，但本文选用铝与芹菜素形成配合物，用荧光光度法测定，该方法简单快速，且避免了贵重试剂的使用，是一种快捷测定芹菜素的好方法，现介绍如下。

1 材料与仪器

芹菜素（纯度≥98%，南京广润生物制品有限公司），三氯化铝、氢氧化钠、无水乙醇等其余试剂为国产分析纯。

F95S荧光分光光度计（上海分析仪器总厂）；AR323CN型电子天平（美国奥豪斯）；FE20 pH计（梅特勒-托利多）；DK-8D电热恒温水槽（上海齐欣）；600数显三用恒温水箱（常州澳华）。

2 实验方法

2.1 实验所需试剂的配置

2.1.1 90%乙醇溶液的配置准确量取无水乙醇溶液450m l，滴加NaOH溶液调节溶液pH值为规定值，加三蒸水定容至500m l。

2.1.2 芹菜素标准溶液的配置准确称取0.27 g芹菜素，加入90%乙醇溶解、定容，配制成2.0×10-3mol/L的芹菜素标准溶液500ml。

2.1.3 三氯化铝标准溶液的配置准确称取0.134 g三氯化铝，加入90%乙醇溶解、定容，配制成1.0×10-3mol/L的三氯化铝标准溶液1 000m l。

2.2 芹菜素铝配合物荧光光度法测定

取10ml具塞比色管，依次加入1ml芹菜素标准溶液和三氯化铝标准液1m l，用90%乙醇稀释至刻度，振荡摇匀后避光放置一段时间，于1 cm比色皿，用激发波长365 nm，发射波长480 nm测量其荧光强度F和F0（空白实验），计算ΔF=F-F0。

2.3 正交试验优化芹菜素铝配合物荧光光度法测定的条件

在单因素实验基础上，对实验反应温度、pH值和反应时间3个因素各设计3个水平进行L9（34）正交试验（见表1），以荧光强度ΔF为评价指标，综合审评后确定优化方案。

表1 正交试验因素水平

3 结果

3.1 测定波长的选择

本实验研究发现，芹菜素和三氯化铝在90%乙醇溶液中均无荧光现象，而芹菜素铝配合物在激发波长（λex）365 nm，发射波长（λem）480～504 nm处有较强的荧光峰，因此本实验选择λex=365 nm，λem=490 nm为以下实验的测定波长。

3.2 单因素实验结果

3.2.1 溶液pH值对荧光测定的影响（见图1）由图1可知，当乙醇溶液pH值为6.5时，芹菜素铝配合物的荧光强度最强，在溶液pH值较高或较低时，荧光均不稳定，荧光强度降低，且在pH值为8时，溶液出现轻微混浊，影响荧光测定，因此实验选用乙醇溶液的pH值为6.5。

3.2.2 反应时间对荧光测定的影响（见图2）由图2可知，当待测液混合均匀，避光放置10分钟后荧光强度达到最大值，且90分钟内待测液荧光强度值基本趋于稳定。因此，本实验选择在待测液混合均匀避光放置10分钟后测定其荧光强度。

3.2.3 溶液温度对荧光测定的影响（见图3）与文献研究相似［11］，本实验研究发现待测液混合均匀，避光静置于25℃恒温水浴中15分钟后荧光强度达到最大值；温度高于25℃时，随着温度升高荧光强度逐渐减小；当温度低于25℃时，荧光强度随着温度降低而减小。

图1 溶液pH值对荧光测定的影响

图2 反应时间对荧光测定的影响

图3 溶液温度对荧光测定的影响

3.3 正交试验结果

根据正交试验结果（见表2～3）的数据可知，因素A（反应温度）和因素B（pH值）对芹菜素铝配合物的荧光强度（ΔF）影响较大（P＜0.05）；因素C（反应时间）对芹菜素铝配合物的荧光强度（ΔF）影响不大，说明在待测液混合均匀避光放置10分钟后，荧光强度（ΔF）基本趋于稳定。综合各因素考虑，芹菜素铝配合物荧光光度法测定条件的最优组合为反应温度25℃、溶液pH值为6.5、反应时间为10分钟。

3.4 荧光光度法测定芹菜素铝配合物的线性关系

此外，本研究在优化实验条件下发现，加入不同量的芹菜素标准溶液，按2.2实验方法操作，芹菜素铝配合物的荧光强度（ΔF）与芹菜素在2.0×10-5～3.2×10-4mol/L浓度范围内呈线性关系，回归方程为ΔF=1.4×106C+147.66，相关系数R2=0.996 6。

4 讨论

本实验以芹菜素和三氯化铝为原料，在90%乙醇溶液中迅速混匀反应得芹菜素铝配合物，从而改变芹菜素的荧光吸收特性。对芹菜素铝配合物荧光光度法测定条件的优化发现，其配合物荧光光度法测定条件的最优组合为反应温度25℃、溶液pH值6.5、反应时间为10分钟，这从配合物的荧光强度值（ΔF）得到验证。由极差分析可知，上述3种因素对配合物荧光光度法测定的影响从大到小依次为反应温度＞溶液pH值＞反应时间。此外研究还发现，芹菜素的加入量在一定范围内与芹菜素铝配合物的荧光强度（ΔF）呈较好的线性关系。由此可见，芹菜素能与铝离子在一定条件下形成稳定的荧光配合物，可应用荧光光度法进行检测，据此形成的荧光光度法测定芹菜素含量的方法简单、快捷，为后续对天然药物成分芹菜素的开发利用提供了一种新的检测方法。

表2 芹菜素铝配合物荧光光度法测定条件的优化及正交试验结果

表3 方差分析

［1］史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响［J］.中国药理学通报，2011，27（5）：666-671.

［2］Abate A，Yang G，Wong R J，et al.Apigenin decreases heminmediated heme oxygenase induction［J］.Free Radic Biol，2005，39（6）：711-718.

［3］Liu A L，Liu B，Qin H L，et al.Anti-influenza virus activities of flavonoids from the medicinal plant Elsholtzia rugulosa［J］.Planta Med，2008，74（8）：847-851.

［4］张丽波，姜恩魁.芹菜素对雌性大鼠性周期的影响［J］.辽宁医学院学报，2007，28（1）：13-14.

［5］胡太平，曹建国.芹菜素诱导人胃癌细胞凋亡作用及机制研究［J］.国际病理科学与临床杂志，2007，27（1）：6-10.

［6］Saeed M，Kadioglu O，Khalid H，et al.Activity of the dietary flavonoid，apigenin，against multidrug-resistant tumor cells as determined by pharmacogenomics and molecular docking［J］.JNutr Biochem，2014（10）：13-17.

［7］高瑞斌，杨艳，董树清，等.高效毛细管电泳同时测定大枣中环磷酸腺苷、芹菜素及槲皮素［J］.食品工业科技，2014，35（9）：282-285.

［8］王克勤，罗军武，陈静萍，等.高效液相色谱法测定芹菜中芹菜素含量［J］.食品与机械，2009，25（2）：74-77.

［9］焦燕，王英锋，刘锁兰.LC-MS/MS法同时测定不同产地半枝莲中野黄芩苷和芹菜素含量［J］.药物分析杂志，2009，29（9）：1451-1453.

［10］陶莲春.芹菜素衍生物的制备及活性研究［D］.兰州：兰州理工大学，2012.

［11］姚本林，时小波.槲皮素铝的络合反应及槲皮素的荧光光度测定［J］.理化检验，2002，38（4）：186-187.

G424.31

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1671-1246（2015）18-0103-02