小鼠骨髓细胞中期染色体标本制备方法的改进

刘星，冯昆，张青峰，姬可平，王燕

（遵义医学院珠海校区，广东 珠海519041）

小鼠骨髓细胞中期染色体标本制备方法的改进

刘星，冯昆，张青峰，姬可平，王燕

（遵义医学院珠海校区，广东 珠海519041）

目的改进小鼠骨髓细胞中期染色体标本制备的方法，以利于在实验教学中应用。方法设定不同浓度梯度的秋水仙素，分别作用于小鼠4小时和14小时，调整低渗液浓度及低渗时间、预固定和固定时间、离心速度及离心时间、滴片高度等，制作出分散良好、形态清晰的染色体标本。结果经过多次反复实验比较，秋水仙素注射剂量为10μg/g BW作用4小时和5μg/g BW作用14小时，低渗液处理15分钟，预固定2分钟，固定10分钟，2 500转/分，离心5分钟，滴片高度50～80 cm，可获得理想的实验结果。结论改进后的实验方法不仅能有效地缩短实验操作时间，而且可以提高实验教学质量，可应用于相关实验教学。

小鼠；骨髓细胞；中期染色体；制备方法

染色体的结构和数目是研究生物体遗传、变异、发育等的基础［1］，染色体制备对人类遗传病的研究和诊断有着非常重要的意义［2］，也是进行染色体原位杂交、染色体畸变、染色体核型分析和显带分析等研究的重要基础。制备小鼠染色体标本是各大农业、生物和医学院校细胞生物学、遗传学、医学遗传学等实验课程中重要的实验内容之一。通过实验，学生可了解小鼠染色体的数目及形态特征，掌握中期染色体制备的实验原理和方法。该实验操作步骤简单，但每个步骤稍有不慎将导致实验失败，不能在镜下观察到清晰的、分散好的中期染色体。另外，实验要求提前对实验动物进行预处理，因此对实验课程开设的时间有所限制。国内很多学者一直在不断地探索和改进小鼠染色体的制备方法［3-8］，如增加取材部位，调整低渗液浓度，改变低渗时间、滴片高度和收集细胞的方式等，但仍存在实验耗时长、结果不稳定等不足，不利于在实验教学中广泛应用。近几年来，笔者在细胞生物学的实验教学中，参照各种改进方法，反复摸索秋水仙素的注射剂量和作用时间、低渗时间、预固定和固定时间、离心速度及离心时间等，进一步改进了实验操作方法，有效地缩短了整个实验的操作时间，提高了实验教学质量，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用昆明种小鼠，健康清洁级，体重（22±2）g，由广东省医学实验动物中心提供。

1.2 主要药品与试剂

秋水仙素（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20111215）；吉姆萨染液（天津市天新精细化工开发中心，批号：20120521）；甲醇、冰醋酸、KCl注射液、NaCl注射液（天津市大茂化学试剂厂）；眼科剪；低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-80-2B）；双目光学显微镜（重庆奥特光学仪器，型号：SMARTe-320）。

1.3 方法

1.3.1 常规实验方法（1）实验动物处理：选取健康小鼠于实验前4小时腹腔注射10μg/g BW（体重）秋水仙素。（2）收集骨髓细胞：颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剥取股骨，小心去除股骨两端，用注射器吸取5mL低渗液（0.075mol/L KCl）冲洗骨髓入离心管中，反复离心至股骨泛白。（3）低渗处理：将离心管置于37℃水中，水浴30分钟。（4）预固定：加入新鲜固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）2mL，轻轻混匀后静置10分钟。（5）离心：1 000转/分离心10分钟。（6）固定：弃上清液，将沉淀加入固定液5mL，轻轻混匀后静置30分钟。（7）收集细胞：相同条件再次离心，弃上清液。（8）制细胞悬液：重新加入固定液0.3～0.5mL，混匀。（9）滴片：取-20℃预冷冻的洁净载玻片，吸取少许细胞悬液，于25 cm以上高度滴下，立即吹气以便细胞悬液更快分散。（10）微烤：于酒精灯火焰上方往返5次，自然晾干。（11）染色：置于吉姆萨染液中染色8分钟。取出标本，流水冲洗，室温晾干，置于显微镜下进行镜检。

1.3.2 改进后的实验方法（1）实验动物处理：实验前14小时和4小时分别腹腔注射5μg/g和10μg/g BW秋水仙素。（2）同常规实验方法处死动物，收集细胞。（3）低渗处理：0.070 mol/L KCl，于37℃水中水浴15分钟。（4）预固定：加入固定液轻轻混匀静置2分钟。（5）离心：2 500转/分离心5分钟。（6）固定：加入固定液5mL混匀后静置10分钟。（7）收集细胞：相同条件再次离心。后续步骤与常规实验方法一致，但滴片高度提高到50～80 cm。

2 结果

常规实验方法制作的标本中，可见形态清晰的中期染色体，但中期分裂相少，染色体分散性较差。改进后的实验方法制作的标本中，可见大量数目完整、形态清晰、分散均匀的中期染色体。与常规实验结果相比，中期分裂相明显增多，染色体形态也更为清晰可见。

改进后的实验方法不但节省了实验操作时间，还提高了学生实验操作效率，两种方法的比较见表1。

表1 常规实验方法与改进后实验方法的比较

3 讨论

3.1 秋水仙素的配制、注射技巧和作用时间

秋水仙素选用NaCl注射液进行配制，浓度为0.2 mg/mL。配好后于冰箱中放置几天，使秋水仙素充分溶解，以保证药效。秋水仙素可阻断纺锤丝微管的组装，使染色体不往两极移动，分裂期停滞在中期，从而获得形态最为清晰、典型的中期染色体［6］。因此，注射秋水仙素的剂量和作用时间与能否获得大量形态清晰的中期染色体密切相关，也是最为关键的一步。注射时一定要牢牢固定住小鼠，使其头部微微朝下，在其右腹腔注射，缓缓将药液推入，注射过程中要防止小鼠的后肢将注射器蹬出。注射完毕应停留片刻，有利于药液吸收。拔针时应旋转出针，可有效避免药液回流，以保证秋水仙素的注射剂量。

秋水仙素注射剂量太大、作用时间太长容易导致小鼠死亡，还会使染色体过分收缩或着丝粒分离，形态过于短小。注射剂量太少、作用时间太短，则不能有效阻止细胞分裂停留在中期，导致中期分裂相少［9-10］。因实验动物需提前注射秋水仙素，所以一般只局限在下午开设实验课。为了解决时间限制的难题，笔者设定了两个浓度梯度（5μg/g BW和10μg/g BW）的秋水仙素，分别作用14小时和4小时。经过多次实验比较发现，秋水仙素5μg/g BW作用14小时，10μg/g BW作用4小时可获得较好的实验结果，从而解决了该实验项目的时间限制问题，更利于实验项目的开展。

3.2 低渗液的浓度及时间的选择

低渗处理也是实验成败的关键步骤之一，低渗的目的是使细胞充分吸水膨胀但不至于破裂，使中期染色体松散，利于后期标本的制作。低渗时间太长、低渗溶液浓度过低容易使细胞提前破裂，导致染色体丢失。低渗时间太短细胞吸水膨胀不够，不利于后期细胞破碎和染色体分散［11-12］。为了节省时间，提高实验效率，笔者经多次反复实验比较发现，将低渗液浓度由0.075 mol/L调低至0.070mol/L［4］，低渗时间由30分钟缩短至15分钟，后期可制作出中期分裂相多且分散好的标本。

3.3 固定液的要求和固定时间的选择

固定液选用甲醇和冰醋酸体积比3∶1进行混合，一定要现配现用，以防液体挥发影响固定效果。预固定和固定的目的是为了防止细胞结团，使染色体形态清晰可见［12］。常规实验预固定和固定时间通常较长，笔者通过多次实验发现，预固定处理2分钟和处理10分钟甚至更长时间所得实验结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）结果与文献报道一致［9］。同时还比较了不同固定时间对染色体制备的影响，发现固定10分钟即可获得形态清晰的中期染色体，与其他固定时间效果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.4 离心速度和离心时间的选择

以往实验步骤中离心速度为1 000转/分，离心10分钟。为了提高实验效率，笔者将离心速度提高到2 500转/分，离心5分钟。经过实验结果比较，发现提高转速、缩短离心时间对实验结果无影响。

3.5 冰载玻片的要求和滴片高度的选择

在实验操作时，冰载玻片应一直保持低温状态，在冰层未融化之前进行滴片，这样有利于液滴迅速散开并在玻片上，同时低温也有利于膨胀的细胞破碎，使染色体充分散开。滴片高度是影响实验结果成败的关键步骤，高度不够细胞不易破碎，染色体不能充分释放，粘成一团，不利于观察。滴片太高不易滴准，且飞溅出的液体较多，浪费标本，还会造成染色体过分分散甚至出现染色体断裂或者丢失［13-14］。通过摸索发现，滴片高度在50～80 cm制作的标本比较理想，染色体不但形态清晰、分散好，而且能在高倍镜下计数染色体的条数，并可做进一步分析。

［1］丁鸿，邱东萍，陈少雄.植物染色体标本的制备和染色体核型分析研究进展［J］.南方农业学报，2012，43（12）：1958-1962.

［2］徐文瑜，陈彦明，黄月娇.外周血染色体制备成功方法的探讨［J］.中国社区医师：医学专业，2013，15（8）：222-223.

［3］陈晓东，吴玲.小鼠雄性生殖细胞染色体制备方法的改进［J］.包头医学院学报，2001（3）：228.

［4］苏爱，刘金成，王振华，等.小鼠睾丸生殖细胞减数分裂标本制作方法的改进［J］.青岛大学医学院学报，2006，42（4）：366，368.

［5］朱娟娟，赵斌，刘莉茵，等.小鼠骨髓细胞染色体制备实验方法的改进［J］.安徽医药，2007，11（8）：768.

［6］刘庆军，孙永君.小鼠骨髓细胞染色体标本制备方法的改进［J］.山东轻工业学院学报：自然科学版，2012，26（4）：64-65.

［7］李栋，张亚龙，刘俊，等.小鼠骨髓细胞染色体G显带制备实验的问题与改进［J］.生物学通报，2012，47（9）：48-49.

［8］刘俊，李栋，张亚龙，等.小鼠骨髓染色体G显带最佳制备方法的探究［J］.畜牧与饲料科学，2012，33（5）：21-22.

［9］赵淑娟，庞有志，白俊艳，等.禽类骨髓细胞染色体标本制备实验方法的改进［J］.实验动物科学，2010，27（2）：17-20.

［10］李标.浅谈成功制作小鼠骨髓细胞染色体标本方法［J］.科学教育，2008（4）：69-70.

［11］唐慕湘，张兴华，陈家强，等.小鼠染色体制备方法初探［J］.解剖学研究，2011，33（2）：160-163.

［12］洪燕，罗丹，龚玮.小鼠睾丸染色体标本的制备方法的研究［J］.科技广场，2012（12）：235-237.

［13］梁仁敏，张伟永，杨子红，等.小鼠中期染色体制备方法探讨［J］.生物技术通讯，2010，21（5）：718-720.

［14］刘涌涛，马全祥，刘慧娟.小鼠骨髓细胞染色体标本制备中的失误与对策［J］.生物学通报，2003，38（6）：53-54.

G424.31

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1671-1246（2015）18-0101-02