LC-MS/MS法测定水基胶中的3种异噻唑啉酮类防腐剂

卢昕博，肖卫强，许高燕，史春云，蒋健，周国俊

浙江中烟工业有限责任公司,杭州市西湖区科海路118号 310024

LC-MS/MS法测定水基胶中的3种异噻唑啉酮类防腐剂

卢昕博，肖卫强，许高燕，史春云，蒋健，周国俊

浙江中烟工业有限责任公司,杭州市西湖区科海路118号 310024

建立了测定水基胶中3种异噻唑啉酮的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法。水基胶样品经水萃取、离心后进行LCMS/MS 分析，内标法定量。结果表明：MI、CMI在浓度范围2.5～250 ng/mL、BIT在浓度范围5～500 ng/mL内，线性关系良好（R2≥0.9996），3 个加标水平的加标回收率在96.3%～109.6%之间，平均相对标准偏差（RSD）在1.5%～6.7%之间，方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.011～0.015 mg/kg和0.035～0.051 mg/kg。该方法适用于水基胶中MI、CMI、BIT的快速测定。

异噻唑啉酮；LC-MS/MS；水基胶

异噻唑啉酮类化合物是一类高效、广谱防腐剂，对细菌、真菌、藻类等具有良好的杀灭效果，被广泛应用于工业循环冷却水、胶黏剂、纺织、涂料、造纸等领域[1-4]。

水基胶是通过乳液聚合而成的含水胶乳，易受微生物侵袭，在水基胶中添加异噻唑啉酮可以起到杀菌防腐的作用。异噻唑啉酮类化合物，尤其是5-氯-2-甲基-异噻唑啉-3-酮（CMI）和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MI）具有皮肤刺激性，并且是强过敏源，即使在规定浓度范围仍有可能导致过敏[5-7]。欧盟指令规定化妆品中CMI/MI(3:1)混合物的添加上限为0.0015%，MI的添加上限为0.01%[8]。烟用水基胶由于可能会直接接触消费者的口腔，其安全性非常重要，因此有必要建立水基胶中异噻唑啉酮含量的测定方法。

已报道的异噻唑啉酮类化合物分析方法的研究主要集中在家居产品、护肤品、环境水监测、纸制品等领域[9-12]。异噻唑啉酮的检测方法主要有紫外分光光度法[13]、气相色谱法(GC)[14]、气相色谱-质谱联用法 (GC-MS)[15]，液相色谱法 (HPLC)[16-17]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[18]等。已有报道采用高效液相色谱法测定水基胶中异噻唑啉酮[19,20]，但高效液相色谱法分析时间长、灵敏度不高，相比之下LCMS/MS分析时间短、节省溶剂、灵敏度高，选择性好，更加适合复杂体系中异噻唑啉酮类化合物的测定。本文建立了同时测定水基胶中3种异噻唑啉酮类防腐剂的LC-MS/MS方法，旨在快速准确测定水基胶中异噻唑啉酮的含量。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

市购水基胶样品。

2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MI）、5-氯-2-甲基-异噻唑啉-3-酮（CMI）、1,2-苯并异噻唑基-3(2H)-酮（BIT）（纯度≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司），内标1,2-苯并异噻唑基-3(2H)-酮-13C6（BIT-13C6）（纯度≥98.0%，加拿大Tornoto Research Chemical公司）标样，甲醇、甲酸（色谱纯，美国Dikma 公司），水为自制超纯水。

Thermo Scienti fi c TSQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪、Thermo Scienti fi c Surveyor Plus 高效液相色谱系统（美国Thermo Fisher公司）；CORTECS C18+ 色谱柱（2.1 mm ×100 mm，2.7 μm，90 Å，美国Waters 公司）；Sigma 4-16K高速离心机（德国Sigma公司）；KQ500-DB 超声波发生器（江苏昆山超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；XP205 电子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取50 mg MI、CMI、BIT于各自的50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到浓度为1 mg/mL MI、CMI、BIT的标准储备液；分别取1 mL BIT，0.5 mL的MI、CMI标准储备液于100 mL 容量瓶中，以水定容，得到MI、CMI、BIT浓度分别为5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的混合标准溶液；准确称取1 mg内标BIT-13C6于10 mL 容量瓶中，用水定容，得到浓度为100 μg/mL的内标溶液。

1.2.2 样品处理与分析

准确称取1 g样品于100 mL锥形瓶中，加入20 mL水及20 μL内标溶液振荡萃取10 min，以10000 rpm转速离心15 min，取上层清液，经0.22 μm水相滤膜过滤后直接进样分析。

LC-MS/MS条件为：色谱柱：CORTECS C18+色谱柱，配有预柱（2.1×5 mm，2.7 μm，90 Å）；流动相：A为甲醇，B为水；洗脱梯度：0～4 min，30%A → 60%A；4.1～6 min，100%A；6.1～ 8 min，30%A；流速：0.2 mL/min；柱温：30℃ ；进样体积：10 μL；离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：选择反应监测（SRM）；电喷雾电压：4000 V；离子源温度：350℃ ；气化温度：350℃；碰撞气为高纯氩气，压力为0.20 Pa；鞘气、辅助气为氮气，鞘气流量：10 L/min，辅助气流量：5 L/min；各防腐剂及内标的质谱采集参数如表1所示。

表1 MI、CMI、BIT、BIT-13C6的质谱采集参数Tab. 1 MS/MS acquisition parameters for MI, CMI, BIT and BIT-13C6

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的建立

MI、CMI、BIT均是含氮杂环化合物，易于结合氢离子形成正离子，因此选择正离子模式进行检测。将异噻唑啉酮标准储备液及内标溶液稀释一定倍数，得到浓度为1 μg/mL的标准样品。通过注射泵将标准样品以5 μL/min的流速导入质谱仪，同时以30%甲醇溶液做流动相并设置流速为0.2 mL/min，进行一级质谱分析，使待测化合物的准分子离子峰峰强度为106左右，优化透镜补偿电压、喷雾电压、鞘气压力、辅助气压力、离子源温度、气化温度获得待测化合物稳定的准分子离子峰。之后选择碰撞气压力为0.2 Pa，分别对分子离子进行二级质谱碎片分析，优化碰撞能量，找到强度较大的3个子离子，其中丰度最高的特征子离子作为定量离子，其它两个作为定性离子（表1）。定性条件为：样品中待测物质的保留时间与标准品的保留时间偏差在6s之内；具有1个定量离子、2个定性离子；待测样品定性离子的相对丰度与浓度临近的标准工作溶液定性离子的相对丰度之间的偏差应在20%以内。

2.2 流动相的选择

以甲醇-水作为流动相，考察了在0%～0.2%浓度范围内甲酸对目标化合物质谱响应的影响。采用1.2.2的梯度洗脱程序，调节流动相中的甲酸浓度，待系统平衡后，进样浓度为25 ng/mL的异噻唑啉酮混合标准样品，平行进样6次，取平均值，结果如图1所示。随着甲酸浓度的增加，目标化合物的质谱响应降低，因此，采用甲醇-水溶液作为流动相。

图1 甲酸浓度对异噻唑啉酮质谱响应的影响Fig. 1 Effect of formic acid concentration on the MS response to isothiazolinones

2.3 前处理条件的确定

2.3.1 萃取溶剂的选择

异噻唑啉酮在水及醇中溶解性都较好，但采用高浓度甲醇溶液萃取会产生以下两个问题：水基胶中的异噻唑啉酮得到的萃取溶液与流动相不匹配，在流动相中会有不溶物析出；高浓度甲醇做萃取溶剂得到的样品，由于溶剂效应会导致样品峰变型、柱效降低。本文考察了水、30%甲醇、50%甲醇溶液对萃取效果的影响。选取市购含有3种异噻唑啉酮的水基胶样品，分别称取样品1 g，加入20 mL溶剂萃取，在其他条件不变的情况下按1.2.2方法处理后进样分析，结果如图2所示：不同浓度的甲醇溶液对萃取效果影响不明显。由于，水基胶在水溶液中的分散性更好，并且以水做溶剂萃取样品经济、环保，因此本文选择水作为萃取溶剂。

图2 不同浓度甲醇水溶液对异噻唑啉酮萃取效果的影响Fig. 2 Effect of methanol concentration on the extraction of isothiazolinones

2.3.2 萃取方式和时间的选择

其他条件不变的情况下对样品分别进行超声萃取30 min和振荡萃取30 min，结果如图3所示。两种萃取方式测得的异噻唑啉酮浓度接近，根据目测效果，振荡萃取更有利于水基胶的分散，因此选择振荡萃取方式。

图3 萃取方式对异噻唑啉酮萃取效果的影响Fig. 3 Effect of different extraction methods on the extraction of isothiazolinones

其他条件不变的情况下对样品分别进行振荡萃取10 min、20 min、30 min，结果如图4所示。由于水基胶在水中分散性好，延长萃取时间对萃取效果没有影响，因此，选择萃取时间为10 min。

图4 萃取时间对异噻唑啉酮萃取效果的影响Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction of isothiazolinones

2.4 方法评价

2.4.1 标准工作曲线、检出限与定量限

准确移取0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL的混合标准溶液，置于50 mL容量瓶中，然后准确加入50 μL浓度为100 μg/mL的内标溶液，以水定容至刻度，即得MI、CMI浓度范围为2.5～250 ng/mL BIT浓度范围为5～500 ng/mL的系列标准工作溶液。按照1.2.2 节所述条件进行LCMS/MS 分析，标准溶液及样品溶液选择离子色谱图如图5、图6所示。以异噻唑啉酮和内标物峰面积比对其相应浓度进行回归，得到3种异噻唑啉酮的标准曲线，结果如表2所示。由表2可知，在所采用的色谱条件下，3种异噻唑啉酮均具有较好的相关性（R2≥0.9996），适合于定量分析。将最低浓度的标准工作溶液重复进样10次，计算标准偏差，以3 倍标准偏差为方法的检出限（LOD），10倍标准偏差为定量限（LOQ）。异噻唑啉酮的LOD范围为 0.011～0.015 mg/kg，LOQ 范围为 0.035～0.051 mg/kg。

图5 异噻唑啉酮标准溶液SRM色谱图Fig. 5 SRM chromatograms of isothiazolinones standards

图6 样品溶液SRM色谱图Fig. 6 SRM chromatograms of isothiazolinones samples

表2 MI、CMI、BIT的回归方程、检出限及定量限Tab. 2 Regression equations, LOD and LOQ of MI, CMI and BIT

2.4.2 回收率与重复性

取水基胶样品3份，分别按照低、中、高三个水平加入3种异噻唑啉酮标准溶液，每个添加水平重复测定5个样品，并由加标量以及加标测定量计算回收率，结果见表3。从表3可知，3种异噻唑啉酮的平均加标回收率在96.3%～109.6%之间，平均相对标准偏差（RSD）在1.5%～6.7%之间，表明本方法回收率高，重复性好，适合定量。

表3 方法的的回收率与精密度Tab. 3 Recoveries and precisions of the method

2.5 实际样品分析

采用本方法测定了10个市购样品。10 个样品中均检出MI，含量范围为0.13～2.47 mg/kg；有8个样品检出CMI，含量范围为0.22～1.16 mg/kg；有1个样品检出有BIT，含量为0.37 mg/kg，其中，BIT不在欧盟指令化妆品防腐许可使用名单内。10个水基胶样品中MI和CMI含量之和小于3.63 mg/kg，小于欧盟指令规定化妆品中CMI/MI混合物的添加上限。

3 结论

建立了水基胶中3种异噻唑啉酮类防腐剂的液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）分析方法。该方法线性良好（R2≥0.9996），加标回收率在96.3%～109.6%之间，平均相对标准偏差（RSD）在1.5%～6.7%之间，检出限范围为0.011～0.015 mg/kg，定量限范围为0.035～0.051 mg/kg。相比液相色谱法[19,20]，该方法分析时间短、节省溶剂、灵敏度高、选择性好，适合水基胶中MI、CMI、BIT的快速测定。

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Determination of 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive by LC-MS/MS method

LU Xinbo, XIAO Weiqiang, XU Gaoyan, SHI Chunyun, JIANG Jian, ZHOU Guojun
China Tobacco Zhejiang Industrial Co., LTD., Hangzhou 310024, China

A method for determining 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed. The sample was extracted with water, centrifugated, and then analyzed by LCMS/MS and quanti fi ed by internal standard method. Results showed that: the linear relationship was good with determination coef fi cients R2≥ 0.9996 in the MI and CMI concentration range of 2.5～250 ng/mL and in the BIT concentration range of 5～500 ng/mL. The recoveries of standard addition ranged from 96.3% to 109.6% with relative standard deviation (RSD) of 1.5%～6.7%. The limit of detection was between 0.011 and 0.015 mg/kg, and that of quanti fi cation was between 0.035 and 0.051 mg/kg. It was concluded that this method was suitable for the determination of 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive.

isothiazolinone; LC-MS/MS; water-based adhesive

卢昕博,肖卫强,许高燕,等. LC-MS/MS法测定水基胶中的3种异噻唑啉酮类防腐剂[J]. 中国烟草学报，2015,21（4）

卢昕博（1981—），博士，工程师，主要从事烟草化学研究工作，Email：luxb@zjtobacco.com

周国俊（1973—），博士，研究员，主要从事烟草化学研究工作，Email：zhougj@zjtobacco.com

2015-02-14

:LU Xinbo, XIAO Weiqiang, XU Gaoyan, et al. Determination of 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive by LCMS/MS method [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(4)