脱除天然橡胶胶乳和手套中的蛋白质

王进文 编译

（西北橡胶塑料研究设计院有限公司，陕西 咸阳 712023）

脱除天然橡胶胶乳和手套中的蛋白质

王进文 编译

（西北橡胶塑料研究设计院有限公司，陕西 咸阳 712023）

采用漂洗和脱蛋白方法去除了天然橡胶中的蛋白质。对市售天然橡胶手套进行了漂洗处理，用尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）和丙酮脱除工业高氨胶乳（HANR）中的蛋白质。采用经改进的Lowry方法和Kjeldahl方法测定了橡胶的可抽提蛋白质含量和氮含量。经聚焦离子束扫描电镜（FIB/SEM）观察发现，经漂洗后，天然橡胶手套中非橡胶成分的纳米基体消失，有效降低了HANR中的可抽提蛋白质含量和氮含量。结果表明，尿素、SDS和丙酮并用可完全脱除胶乳中的蛋白质。

天然橡胶；胶乳；手套；蛋白质；聚焦离子束扫描电镜（FIB/SEM）

0 前言

过去30年里，人们开发了多种脱除天然橡胶中蛋白质的方法：酶脱蛋白、尿素脱蛋白、十二烷基硫酸钠（SDS）脱蛋白，以及热水漂洗等。其中尿素和热水漂洗两种方法是最受重视的，其可制备低蛋白天然橡胶和无蛋白天然橡胶，可以满足美国食品和药品监督管理局（FDA）的要求。采用脱蛋白方法或漂洗处理后，天然橡胶就可用于医用产品、卫生材料和制品，如手术手套、牙医手套、卫生手套、导尿管、医用气球、矫形橡胶带、粘合膏、奶瓶奶嘴、医用冰袋，以及烹饪手套、衣服松紧带、化妆棉粉扑、橡胶垫等产品。因此，低蛋白天然橡胶和无蛋白天然橡胶可被用于一些新领域或以前不能使用的领域。

以前在分析天然橡胶结构时，我们研究了尿素脱蛋白质方法。研究发现，对于不是化学键合在天然橡胶上的蛋白质，尿素可以有效地使胶粒表面上的蛋白质变性。这些研究结果使我们在天然橡胶脱蛋白质方面取得了技术突破；不再需要水解酶使天然橡胶中的蛋白质变性。因此，与水解酶脱蛋白质方法相比，用尿素脱蛋白质具有显著优势。人们可以使用各种变性剂脱蛋白质，缩短处理时间。例如，我们将水解酶脱蛋白质的处理时间≥24 h缩短到≤10 min尿素脱蛋白质处理时间。此外，我们将天然橡胶的氮含量和可抽提蛋白质含量从约0.40%（质量分数）降低到很低的水平。实际上，用尿素处理后，氮含量和可抽提蛋白质含量低于0.01%（质量分数）和1.0 mg/g 橡胶；而采用水解酶脱蛋白后，此二值分别为0.02%和3.2 mg/g橡胶。尿素脱蛋白质天然橡胶的氮含量和可抽提蛋白质含量显著低于水解酶脱蛋白质天然橡胶。现在，我们可以制备无蛋白质天然橡胶，经3次离心处理后，氮含量和可抽提蛋白质含量低于0.000%和0.0 mg/g橡胶。相比之下，经漂洗后，氮含量和可抽提蛋白质含量相当高，大于0.10%和50 mg/g橡胶。

本研究中，我们采用漂洗方法将可抽提蛋白质的含量降低到与无蛋白质天然橡胶接近的水平。采用经改进的Lowry方法（ISO 12243：2003）测定可抽提蛋白质含量和氮含量。用聚焦离子束/扫描电镜（FIB-SEM ）观察了形态。

1 实验

1.1 试样和试剂

本研究所用天然橡胶样品是工业高氨胶乳（HANR，马来西亚Golden hope公司产品），以及市售天然橡胶手套A和手套B。HANR胶乳的总固体质量分数和干胶质量分数分别为62.1%和60.7%。十二烷基硫酸钠（SDS）是日本Kishida有限公司产品。硫酸、氢氧化钠、无水硫酸钾、硫酸铜、硒、25%（w/v）戊二醛溶液和四氧化锇（质量分数4%）水溶液是日本Nacalai Tesque公司产品。其他试剂是分析纯。

1.2 天然橡胶的纯化

用0.1%的尿素、1.0%的SDS和0.025%的丙酮在室温下处理HANR胶乳，脱除蛋白质。乳脂部分重新分散在含有1.0% SDS和0.025%丙酮的水溶液中，制成DRC为30%的胶乳，之后离心冲洗2次。离心分离橡胶，用甲醇凝聚，再在室温、减压条件下干燥至恒重。将手套A（1 g）用50 ml水在各种条件下漂洗6 h 。本研究采用的温度和pH为：40 ℃下1～10，20～100 ℃下5.5。手套A在50 ℃及减压条件下干燥1周。

1.3 测定

按马来西亚橡胶研究所（RRIM）试验方法B7所述Kjeldahl方法测定橡胶中的氮含量。橡胶试样与催化剂（硫酸钾∶硫酸铜∶硒的质量比为1：2：1）的混合物用浓硫酸溶解。将所得溶液蒸馏，馏分用0.005 mol/L 的硫酸滴定，甲基红作指示剂。

通过DC蛋白质试验测定橡胶试样中的可抽提蛋白质含量。尺寸为2 cm×2 cm的橡胶试样用磷酸缓冲液（1/15 mol/L， pH=7）抽提，比例为1 g橡胶/5 ml磷酸缓冲液。抽提时在40℃下连续搅拌6 h。之后过滤试样，用Bio-Red DC蛋白质分析装置，以牛血清丙种球蛋白（BGG）作为标准，测定沉清液中的蛋白质含量。

用透射电子显微镜（JEOL TEM-2100）观察橡胶试样的形态，加速电压为200 kV。用于TEM观察的超薄切片，用超薄切片机在低于试样玻璃化转变温度（约-80 ℃）下切取。切片厚度约为100 nm，用磷钨酸（PTA）在室温下染色10 min。

块状橡胶试样在室温25%戊二醛水溶液中浸泡12 h ，之后用蒸馏水冲洗1 h。最后用4% OSO4水溶液在室温下染色48 h。用SII Nano Technology SMI-3050SE进行FIB-SEM观察。为了防止处理过程中表面弯曲，在试样表面沉积了一薄层碳。镓离子束在30 kV的加速电压下以30 nm的间隔蚀刻表面，制备断面。在2 kV加速电压下对断面进行SEM观察。由于断面处于扫描电子显微镜（SEM）镜头的对角位，所以对所得SEM图像进行了校正。

2 结果与讨论

表1示出了天然橡胶（HANR）和脱蛋白质天然橡胶中的氮含量，其中A代表丙酮，0.025代表丙酮的含量（0.025%质量分数），丙酮添加到胶乳中。用尿素和SDS处理1 h，再离心分离2次后，天然橡胶中的氮含量从0.279% 降到0.021%，可抽提蛋白质含量从115.2 μg/g橡胶下降到3.2 μg/g橡胶。脱蛋白质天然橡胶（DPNR）的氮含量和可抽提蛋白质含量与酶解脱蛋白质天然橡胶的非常类似（胶乳用水解酶和SDS处理24 h以上，之后离心分离2次）。处理时间大幅缩短，这是因为采用尿素作为变性剂，未使用水解酶。例如，尿素使蛋白质变性时，由于氢键断裂使高级结构变形；而采用水解酶时，由于水解而产生酰化作用。

胶乳用尿素、丙酮和SDS处理1 h，再离心分离2次后，氮含量和可抽提蛋白质含量进一步降低到0.000%和0.0 μg/g橡胶。换言之，用尿素、丙酮和SDS将天然橡胶中的蛋白质完全除去了。这可能是由于丙酮是油脂和脂肪酸的良溶剂（图1）。油脂和脂肪酸可能从胶粒上脱落，在水溶液相形成胶团，可能会使胶粒中产生自由空间。在用尿素和SDS变性后，自由空间可能会使蛋白质更容易从天然橡胶上脱离，这是因为氢键断裂后蛋白质的体积收缩了。释放出来的蛋白质被尿素和SDS稳定在水相中，这是因为蛋白质的憎水部分被尿素和SDS覆盖。因此，去除油脂和脂肪酸后胶粒结构松散，蛋白质会自然脱落。所得纯化天然橡胶据称是无蛋白质橡胶，因为其不含蛋白质。本研究发现，需要离心分离2次才可以将天然橡胶中的蛋白质除掉。

表1 天然橡胶（HANR）、脱蛋白质天然橡胶（DPNR）和无蛋白质天然橡胶（PFNR）的氮含量和可抽提蛋白质含量

图1 用尿素、极性溶剂和SDS从天然橡胶中脱除蛋白质的示意图

表2示出了天然橡胶手套A和手套B（市售产品）的氮含量和可抽提蛋白质含量。手套A和手套B的氮含量值类似。但是手套A的可抽提蛋白质含量是手套B的2倍。可抽提蛋白质含量值显著高于美国FDA推荐的标注值（＜50 μg/g橡胶）。因此，手套A和手套B不符合法规要求，不能出口到美国。本研究中，我们用手套A作为漂洗试验的试样，因为其氮含量值和可抽提蛋白质含量分别大于0.2%和600 μg/g橡胶。

表2 天然橡胶手套A和天然橡胶手套B的氮含量和可抽提蛋白质含量

图2所示为天然橡胶（HANR）、无蛋白质天然橡胶和手套A的透射电子显微镜（TEM）照片。暗区是蛋白质，亮区是天然橡胶［蛋白质由磷钨酸（PTA）进行了染色］。由图2（A）可清楚地看出，HANR拥有纳米基质结构，主要组分是平均直径约为1 μm的天然橡胶粒子，蛋白质基体平均厚度约为15 nm。从HANR中脱除蛋白质后，纳米基质结构消失，这由无蛋白质天然橡胶［图2（B）］的TEM照片可以看出。这说明，天然橡胶中含有蛋白质时会出现纳米基质结构。纳米基质的厚度可能取决于蛋白质的含量。

图2 HANR（A）、无蛋白质天然橡胶（PFNR）（B）和天然橡胶手套A（C）的TEM图像

手套A也具有纳米基体结构，如图2（C）所示。手套A 的纳米基体结构几乎与HANR的相同；例如，纳米基体的厚度约为15 nm。这可能是因为与HANR一样，手套A具有较高的氮含量（0.251%）和可抽提蛋白质含量（692 μg/g橡胶）。这证明手套A 含有大量的蛋白质，足以形成纳米基体结构。

图3所示为手套A 漂洗试验中可抽提蛋白质含量与pH的关系；漂洗在40 ℃下进行6 h。可抽提蛋白质含量显著取决于漂洗试验的pH。pH为1.9时，漂洗后，可抽提蛋白质含量从692 μg/g橡胶下降到86 μg/g橡胶；pH大于6.8时，则蛋白质含量低于200 μg/g橡胶。相比之下，pH为4.0和5.5时，手套A 漂洗后的蛋白质含量为633 μg/g橡胶和611 μg/g橡胶，与未处理手套A的可抽提蛋白质含量692 μg/g橡胶相近。手套A 可抽提蛋白质含量随漂洗试验中pH而变化，这可能与天然橡胶中存在的蛋白质的稳定性有关。例如40 ℃下，在pH 4到6之间的条件下，橡胶蛋白质不稳定，这是因为橡胶蛋白质的等电点在酸度系数（pKa）约为4处。水相中不稳定的蛋白质可能会返回橡胶粒子表面，会使可抽提蛋白质含量增大。天然橡胶手套在使用过程中也可能会发生同样的情况。在中温条件下，蛋白质可能不能从手套中抽提出来，因为人类皮肤的pH为4.5到6.0，温度约为40 ℃。但是，出汗后，从手套中抽出的蛋白质量可能会增大，因为汗的pH为7.0～8.0。这样就会产生胶乳过敏问题。例如，以前的研究表明，在接触手套A 这种高蛋白含量天然橡胶手套时，身体健康的人发生胶乳过敏的比率为30%。此外，我们发现，温度40 ℃不足以从天然橡胶中脱除蛋白质，不能达到FDA的标识要求值，即50 μg/g橡胶。

图3 天然橡胶手套A可抽提蛋白质含量随pH的变化

pH对手套A 氮含量的影响示于图4。氮含量几乎与漂洗pH无关（在40 ℃下漂洗6 h）。这意味着天然橡胶手套表面的蛋白质量与蛋白质总量相比很少。但是严格地说，在pH 4.0和pH 5.5条件下漂洗时，漂洗后手套A的氮含量稍高。氮含量较高可能与可抽提蛋白质含量较高有关，说明漂洗后保留了大量的蛋白质。漂洗后，氮含量＜0.2%，比手套A（0.251%）的低。所以脱除的蛋白质量约为天然橡胶中存在的蛋白质总量的20%。因而证实漂洗只能有效脱除橡胶手套表面的蛋白质。

图5所示为在pH 5.5及不同温度条件下漂洗6 h后的可抽提蛋白质含量。在20 ℃和40 ℃下漂洗6 h后，可抽提蛋白质含量较高，说明在漂洗过程中脱除的蛋白质较少。相比之下，在60 ℃、80 ℃和100 ℃下漂洗时，可抽提蛋白质含量低于200 μg/g橡胶，大约是未处理时的1/3。从图5和图3的结果可看出，漂洗的适宜条件是温度高于60 ℃，pH大于7.0。图6示出了在pH 5.5及各种温度条件下漂洗6 h后手套A的氮含量。在20 ℃下漂洗后，手套A氮含量未发生变化，但在高于40 ℃下漂洗后，氮含量降低到0.2%以下。所以漂洗温度是天然橡胶脱除蛋白质的重要因素，而且60 ℃是一个关键温度，该温度下可脱除20%～30%的蛋白质。

图4 天然橡胶手套A氮含量随pH的变化

图5 天然橡胶手套A可抽提蛋白质含量随温度的变化

图6 天然橡胶手套A氮含量随温度的变化

手套A和漂洗后手套A的FIB-SEM图像示于图7。漂洗在pH 5.5及不同温度下进行6 h。暗区是天然橡胶，亮区是非橡胶组分，如蛋白质和磷脂。未漂洗手套A作为参比试样，用Ga离子从表面蚀刻20 μm深后，观察到了纳米基体结构。直经约1 μm的橡胶粒子均匀分散在非橡胶组分（如蛋白质和磷脂）的纳米基体中。从FIBSEM（图7）观察到的纳米基体结构与TEM（图2）所观察到的相同，说明从表面到内部都均匀地形成了这种纳米基体结构。手套A在20 ℃下漂洗后纳米基体结构未发生变化，因为氮含量与可抽提蛋白质含量未改变。但是，手套A在60 ℃和80 ℃漂洗后纳米基体结构消失，在FIBSEM图像中未观察到杂合结构。假定手套A 的厚度为1 mm，漂洗时从表面脱除20%的蛋白质，则估计是脱除了表面深度100μm以内的蛋白质。脱除蛋白质表面层的估计厚度与图7所示结果一致，图7表明，漂洗后，从表面到20 μm深未观察到杂合结构。证明在特定条件下（温度高于70 ℃，pH大于7），漂洗可以有效地从橡胶的表面脱除蛋白质。

图7 天然橡胶手套A在漂洗前（A）， 以及在20 ℃（B）、60 ℃（C）和80 ℃（D）下漂洗后的FIB-SEM照片

3 结论［1］

在各种条件下制备了无蛋白质天然橡胶和漂洗天然橡胶手套，用TEM和FIB-SEM观察其形态。无蛋白质天然橡胶的氮含量和可抽提蛋白质含量分别为0.000%和0.0μg/g橡胶，漂洗天然橡胶手套的相应值为0.175%和86μg/g橡胶。研究发现，制备无蛋白质天然橡胶时需要进行2次离心分离。脱除蛋白质后非橡胶组分的纳米基体结构消失，无蛋白质天然橡胶的整个断面以及漂洗手套的表面（表面以下深20μm）未观察到杂合结构，但脱除蛋白质前存在着这种结构。

［1］ Lina Fukuhara. Removal of Proteins from Natural Rubber Latex and Gloves［J］. Kautsckwk Gummi Kunststoffe，2015， 68（3）:24-28.

［责任编辑：翁小兵］

TQ 337

B

1671-8232（2015）11-0026-05

2015-07-28

王进文（1967— ），男，陕西澄城人，教授级高级工程师，主要从事期刊审校、信息及专业翻译工作，发表论文及译著近60篇。