官厅水库水质特征及水体微生物多样性的响应

孙寓姣，陈 程，2，丁爱中*，赵晓辉，张惠淳（.北京师范大学水科学研究院，北京 00875；2.中国国际工程咨询有限公司资源与环境业务部，北京 00048）

官厅水库水质特征及水体微生物多样性的响应

孙寓姣1，陈 程1，2，丁爱中1*，赵晓辉1，张惠淳1（1.北京师范大学水科学研究院，北京 100875；2.中国国际工程咨询有限公司资源与环境业务部，北京 100048）

针对北京市原水源地官厅水库，选择了上下游共6个采样点进行了不同季节的水质及环境因子特征分析.总体看来，4个季节水体氮磷碳营养物质浓度依次为:夏季＞秋季＞春季＞冬季，夏秋季出现明显水华.上游妫水河水质要好于下游水库库区水质，尤其以夏秋季节最为明显.夏季上游妫水河的总碳、总氮、氨氮、总磷平均浓度为26.5， 0.95， 0.55， 0.077mg/L，而水库库区响应平均浓度分别为111.47， 4.27， 3.16，0.25mg/L.结合PCR-DGGE对不同时期各点水体微生物进行了群落分析，发现上下游水体中细菌群落结构差异很大，水华严重区的细菌群落多样性和丰度要低于比水质较好区域.CANOCA软件分析了夏秋季水华时水体微生物群落变化与环境因子的响应关系，发现细菌群落结构与环境因子（T、pH值、DO、NFR、TP、Fe）之间存在较强的关联.水质较好的上游水体夏秋细菌群落结构主要受温度、DO影响较大；而水质较差的库区水体夏秋季细菌群落结构变化与固氮速率、pH值、总磷的相关性较好.

官厅水库；水华；环境因子；水质；微生物多样性

官厅水库位于北京市西北部，是新中国成立后兴建的第一座大型水库.从20世纪70年代起由于受上游工农业污染，官厅水库水质恶化，富营养化严重，1997年退出北京市应用水体系［1-3］.而先前的监测数据显示，总磷（TP）、氨氮（NH4+-N）、总氮（TN）是官厅水库夏季富营养化的主要贡献因子［4］.近年来，由于北京市饮用短缺，官厅水库的水体修复即成为亟待解决的问题之一.水体中氮营养元素的来源主要有人为源及天然源，目前针对官厅水库氮含量超标的人为来源研究很多，但是对其天然来源的研究则很少.

作为水生生态系统的一个重要组成部分，细菌数量巨大，具有很高的能量转换效率，是水体生态系统能量流动、营养物质交换的重要环节.在水体环境发生变化时，细菌群落结构也会发生相应变化［5-6］.因此细菌群落对水环境质量相互关系十分密切.目前大量研究工作都是针对湖泊中的浮游动植物进行的［7］，而水华过程中水体细菌群落的变化应是研究水体性质变化的一个重要切入点.郑小红等［8］用PCR-DGGE技术对玄武湖的水体进行了细菌群落的变化分析，发现在水华暴发期细菌优势种有16种，生物多样性高，而进入衰退期后优势菌减少，多样性降低， 但细菌数量增大.

本文对官厅水库不同季节水体水质理化指标进行跟踪监测，探索水库水质年度变化情况.监测的水质指标主要包括:温度、pH、DO、、、、TN、TP、BOD5、COD和叶绿素a，以及自然界内源的氮输入方式固氮作用的速率. 分析水体氮磷营养元素含量变化的原因.利用PCR-DGGE技术扩增细菌16srDNA基因来对官厅水库不同区域水体中细菌的群落变化进行了研究，以期发现水体富营养化过程中微生物群落结构的响应关系.进而为水华水质变化及水体中微观生态代谢过程深入讨论提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 采样点设置

水样的采集于7月20日水华发生时进行，本次采样共设6个采样点（S1～S6）如图1所示.其中S1、S2、S3位于官厅水库上游妫水河，S4、S5、S6位于水库库区，采样过程中使用GPS系统对每个采样点进行精确定位，采样点位置S1～S6经、纬度依次为115°46′5″，40°21′58″； 115°42′24″，40°20′51″；115°42′9″，40°20′15；115°36′75″，40°14′1 3；15°35′57″，40°14′7；115°25′39″， 40°14′58.

1.2 水样采集

有机玻璃采样器采集水深0.5m左右处水样.用于测定固氮速率的水样注入经盐酸浸泡洗净、水样反复润洗的玻璃瓶中，低温避光带回实验室.

图1 官厅水库采样点示意Fig.1 Location of sampling sites in Guanting Reservoir

1.3 水样分析

1.3.1 水体理化参数的测定 水温、pH值、溶解氧（DO）浓度现场测定，理化指标当天送样品至北京谱尼测试公司测定，包括-N，-N，总氮（TN）， 总磷（TP）， CODcr， Fe等.叶绿素a（Chl-a）浓度测定在北京理化测试中心完成.

1.3.2 水体固氮速率测定 采用乙炔还原法测定水体固氮速率［9-10］.取1500mL水样8500×g离心20min 后弃上清135mL即将水样浓缩10倍， 取浓缩水样50mL于65mL磨口三角瓶中，用注射器抽取顶端15%的空气，并注入等量乙炔气体，同时用无菌水设置对照.27℃温育72h后加入0.1mL50%TCA终止反应.取100μL顶端气体，气相色谱检测乙炔含量，换算成氮含量表示固氮速率.

1.3.3 总DNA提取及固氮16s基因扩增 水样于24h内经0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，浓缩生物样品.使用Omega Water DNA Kit提取水体微生物的总DNA.

使用16SrDNA V3区通用引物341F-GC和907R（合成于上海生工生物公司）对水样基因组总DNA扩增.在上游引物341f的5'端前面加了一段“GC发卡”结构使后续的DGGE能有更好的分辨率（Poly et al.， 2001）.引物序列（GC_341f:5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3'；907r:5'-CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3'）.以1μL DNA样品为模板，PCR扩增体系含有:5.0μL 10×PCR缓冲液（Takara），4.0μL 2.5mM dNTP混合液，20mM引物各1μL，0.25μL （0.5U/μL） Taq酶 （Takara），无菌水补齐至50μL.采用降落PCR技术扩增，扩增程序为:95℃/5min；94℃/30s，63℃/60s，72℃/90s，8个循环，每个循环降低1℃至56℃；94℃/30s，56℃/60s，72℃/ 90s； 25个循环，72℃/7min.用Omega PCR产物纯化试剂盒对产物进行切胶回收［6］.

1.3.4 16s基因扩增片段变性梯度凝胶电泳（DGGE） 聚丙烯酰胺的变性梯度范围为35%～65%，DNA扩增产物上样量约为200ng，60℃恒温，80V恒压条件下电泳13～15h，电泳完毕后采用银染技术染色，白光成像.随后使用Quantity One软件对DGGE图谱进行分析，分析各泳道条带数目及灰度. 16s基因的多样性使用Shannon-Weaver指数H进行表征.计算公式为:

式中: Pi为每条泳道中第i条条带灰度占该样品总灰度的比率；S为泳道中含有的条带总数.

所有实验数据均在SPSS for windows （15.0）统计软件上进行处理.

2 结果与分析

2.1 基本理化指标全年变化

官厅水库水体温度全年变化较大，春季水体平均温度为4.9℃，夏季为25.9℃，秋季降低到21.9℃，冬季冰面下水体平均温度为3.6℃.水体pH值全年呈碱性，平均值在8.7～9之间，其中秋季水体碱性最大.水体溶解氧春、冬季平均值较高，分别为7.9mg/L，8.7mg/L.，夏季为6.6mg/L，为全年最低，其中妫水河溶解氧平均浓度为7.16mg/L，水库库区仅为6.04mg/L.秋季水体溶解氧浓度相对夏季略有上升，妫水河溶解氧平均浓度上升到8.01mg/L，库区平均浓度上升到6.89mg/L.

2.2 水体叶绿素a全年变化

在饮用水源地和景观娱乐水体，发生水华的界限通常为叶绿素a（Chl-a）含量超过10mg/m3或藻类细胞密度大于20000个/mL［11］.通过对Chl-a浓度的监测，反映了水库全年藻类的生长情况.由图2可以看到，官厅水库4个季节Chl-a的平均浓度分别为1.87，41.79，29.82，2.86mg/m3，夏季秋季水库Chl-a含量超高，水华严重.

图2 官厅水库叶绿素a全年变化Fig.2 Chl-a concentration of different water samples

2.3 有机物浓度全年变化

图3 官厅水库全年COD变化Fig.3 COD concentration of different water samples

从时间上看，官厅水库四季水质变化较大（如图3），尤其是夏季，各项水质指标均严重超标.其中夏季6个采样点 CODcr平均值为68.99mg/L，库区S5采样点处CODcr值最高达到245mg/L，明显高于其他3个季节.从空间上看，妫水河流域采样点（S1、S2、S3）和库区采样点（S4、S5、S6）水质差异明显.库区CODcr浓度远高于妫水河流域.其中夏季妫水河流域采样点平均CODcr浓度为26.5mg/L，而库区采样点浓度值高达111.47mg/L.

2.4 氮、磷营养浓度全年变化

图4 官厅水库总氮，氨氮及总磷全年变化Fig.4 Concentration of total nitrogen， ammonia， and total phosphorus of different water samples in Guanting resevior

官厅水库已经长期处于富营养状态，氮、磷是水库水体主要营养污染物（图4）.通过全年监测发现，春夏秋冬水体总氮的平均浓度分别为:1.14，2.61， 1.29， 0.62mg/L，冬季总氮含量最低，夏季最高，已超过地表V类水标准（图4A）.乙炔还原法对官厅水库4个季节所采水样进行了固氮速率的检测，只有夏季6个采样点监测到固氮速率，水华爆发的采样点S5处固氮速率最高，达到9.35nmolN/（m3·d），其他5个采样点的固氮速率都小于1nmolN/（m3·d）.相比之下，富营养化水平低的妫水河流域固氮速率较库区低很多，最小值0.172nmolN/（m3·d）出现在妫水河S3处.

官厅水库无机氮主要以氨氮形式存在，春季水体氨氮平均浓度为0.33mg/L，夏季上升至1.86mg/L（图4B），最大值为8.18mg/L在S5点处测得；秋季水体氨氮平均浓度又降至0.63mg/L，最大值2.77mg/L仍在S5测得；冬季氨氮浓度平均浓度降低为0.16mg/L.

通过对水体总磷浓度的监测可知（图4C），官厅水库4个季节各采样点总磷平均浓度分别为0.06， 0.16， 0.14， 0.058mg/L.即使在冬季，水库浓度都超过地表Ⅲ类水标准，夏季总磷浓度超过地表Ⅳ类水标准.4个季节水体氮磷营养物浓度依次为:夏季＞秋季＞春季＞冬季.另外从空间分布看，库区采样点总氮、氨氮、总磷浓度明显高于妫水河各点.例如，在三者平均浓度最高的夏季，上游妫水河3个采样点的总氮、氨氮、总磷平均浓度为0.95，0.55，0.077mg/L，表明妫水河水质介于地表湖库Ⅱ类-Ⅲ类水之间.而水库库区3个采样点的总氮、氨氮、总磷平均浓度则分别达到了4.27，3.16， 0.25mg/L，均超过地表湖库Ⅴ类水标准.这表明，官厅水库库区水体水质及营养状态比妫水河严重，尤其以夏秋季最为明显.

2.5 水样DNA的提取及16s基因PCR-DGGE结果扩增分析

为了增加DNA的提取效率，在使用试剂盒提取水体DNA样品的过程中增加了机械力细胞破碎的步骤使水体微生物DNA尽量多的释放.提取出的DNA样品经过1.2%的琼脂糖凝胶电泳检验，片段长度均在23kb左右， OD260/280在1.6～1.8之间.细菌16S rDNA PCR目标片段的条带清晰，位置正确，扩增产物可用于后续DGGE分析.样品的PCR产物经DGGE分析后，官厅水库细菌群落DGGE结果见图5.

图5 官厅水库四季细菌群落DGGE图谱Fig.5 DGGE band profiles of 16s gene iamplified using four seasons genomic DNA

从图5可以看到，21个样品的PCR扩增产物经DGGE分析后，各泳道中均分离出了不同的条带，表明DGGE可以很好的将样品中不同菌种区分开来.泳道条带数目代表各采样点微生物丰度，21个采样点形成了数目不同的条带，且条带的亮度和迁移速率不同，表示官厅水库不同采样点细菌丰度和群落结构不同.

Quantity One 软件对DGGE所得图谱经过泳道识别、去除背景、识别条带、高斯模型分析之后得到各泳道的条带数量（即丰度S），同时得出各条带的光密度（即条带灰度），最后根据Shannon-Weaver公式可以计算出多样性指数H.得到官厅水库全年细菌丰度和多样性的变化如图6.各采样点微生物多样性的计算结果显示，各点微生物多样性差别较大.H的数值在1.47～2.79之间.

图6 官厅水库细菌丰度与多样性变化Fig.6 Richness and diversities of bacteria in different water samples of Guanting resevior

夏季随着水体氮磷营养的升高，水体细菌丰度和多样性上升，总体看来，水质较好的妫水河水体中细菌的多样性和丰度都好于水华严重的库区水体.9月份秋季水华期间大多数点的细菌丰度和水体多样性均有所下降.

2.6 夏、秋季细菌群落与环境因子相关性

在获得官厅水库全年细菌群落变化的基础上，重点分析7月和9月水华期间细菌群落结构的变化，并利用CANOCO软件分析其与环境因子的相关性.结果见图7.

由图7可见，妫水河采样点（S1，S2，S3）在夏、秋季细菌群落结构非常相似，被归为一支，6个样品之间的相似度大于57.4%.其中夏季妫水河S2、S3采样点细菌群落结构更为相似（75.3%），秋季妫水河S1、S3采样点细菌群落结构更为相似.库区采样点夏、秋两季细菌群落结构较为相似，夏季S4、S5细菌群落结构相似度为48.6%.秋季S5、S6群落相似度为48%.由此可见夏季官厅水库S6点细菌群落结构较为特殊，秋季S4点细菌群落结构较为特殊.

图7 官厅水库夏季、秋季细菌群落DGGE指纹图谱UPGMA聚类分析Fig.7 UPGMA of DGGE fringerprint of summer and autumn water samples of Guanting resevior

总体来看，夏秋季水华期间妫水河和库区细菌群落结构差异一直很大，而各自的细菌结构在两次水华期间也有所不同，尤其库区采样点7月和9月的细菌群落结构差异很大.

对7月、9月官厅水库水华期间细菌群落进行聚类分析之后，利用CANOCO for Windows 4.5软件对DGGE结果和环境因子进行多变量统计分析.首先利用DCA对DGGE图谱代表的细菌群落信息进行分析，得到的最长的梯度长度值为2.639，表明应选择线性模型RDA对样品进行排序分析.水样理化指标剔除膨胀因子大于30的指标之后，进行了标准化处理［12］.典型对应分析结果概括于表1.

根据膨胀因子选择了温度（T）、pH值、DO、固氮速率（NFR）、总磷（TP）、Fe作为环境因子表征水体环境变化情况，Monte Carlo检验显示6个环境参数与AX1轴（P=0.026）及全部排序轴（P=0.022）均有显著的相关性.具体对应结果（表1）表明第1排序轴解释了样本中24.4%的变异，第2和第3排序轴分别解释了样本中41.2%和49.3%的变异，前4个排序轴共解释了55.5%的样本总变异，表明排序图能很好的解释官厅水库夏季和秋季的细菌变异情况.从物种-环境的相关性看，第1和第2排序轴的种−环境相关系数分别为0.970和0.984，同时，前4个排序轴的物种−环境累积百分率高达85.9%，这说明水样中细菌群落结构与环境因子间存在较强的关联.水样中微生物群落结构主要与DO、T、TP、NFR相关联，其中DO（R2=0.5306）、T（R2=0.3708）与第1排序轴正相关，TP（R2=-0.4699）与第1排序轴负相关；T（R2=0.7490）、NFR（R2=0.6848）与第2排序轴正相关，pH（R2=-0.6005）与第2排序轴负相关，铁与第1、2个排序轴均有一定的正相关性（R2= 0.1466， 0.3207），但相关程度不高.

表1 官厅水库夏季、秋季细菌群落与环境因子典型对应分析结果Table 1 Data of cooresponding relations between bacterial community and environmental factors

图8 官厅水库夏季、秋季细菌群落与环境因子典型对应分析Fig.8 Typical cooresponding relations between bacterial community and environmental factors

物种环境排序图中2个样品距离的远近表明样品物种群落的相似程度（图8），环境因子的箭头方向与采样点之间的夹角表示其和该点物种群落之间的相关性，夹角越小表示相关性越高，两者箭头若同向，表明正相关，反向表明负相关.从图8可以看到，夏季官厅水库上游妫水河3个采样点距离较近，而其和库区3个采样点的距离远，表明7月水库上游妫水河和下游库区的细菌群落结构差异很大，这和DGGE聚类分析的结果一致.由于夏季水温较高，营养物质较丰富的环境中微生物生长较旺盛，会导致不同环境出现较大的微生物群落差异.从采样点和环境因子的夹角来看，夏季7月妫水河细菌群落受水温的影响较大，库区细菌群落和NFR相关性较好.秋季9月水库6个采样点较为分散，表明9月水库细菌群落结构差异大，其中妫水河细菌群落受DO影响较大，库区细菌群落受pH值和TP影响较大.可见在水质较好地水域，非人为因素（温度等）是影响水体中的微生物群落的关键；而存在营养化污染区域的水体，TP、pH值等相关人为因素的指标，成为影响微生态群落变化的主导因子.

3 结论

3.1 官厅水库四季水质变化较大，库区水质劣于上游妫水河水质，夏季妫水河水质介于地表湖库Ⅱ类-Ⅲ类之间，而库区水质超过地表湖库Ⅴ类水标准.夏季和秋季库区均存在大量的水华.

3.2 用综合营养状态指数法对官厅水库的富营养状况进行评价，结果表明官厅水库全年水体均已经富营养化.水质较好的妫水河水体中细菌的多样性和丰度都好于水华严重的库区水体. 9月秋季水华期间大多数点的细菌丰度和水体多样性均比夏季有所下降.

3.3 对7月和9月水华期间细菌群落和环境因子进行典型对应分析，结果表明细菌群落结构和环境因子（T、pH值、DO、NFR、TP、Fe）之间存在较强的关联.样品中微生物群落结构主要与DO、T、TP、NFR相关，pH值、铁与细菌群落结构关联度最小.7月水华期间妫水河和库区的细菌群落结构差异很大，妫水河细菌群落受水温的影响较大.9月水库各点的细菌群落较为分散，群落差异大，其中妫水河细菌群落受DO影响较大，库区细菌群落受pH值和TP影响较大.

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The corresponding of microbial diversity on water quality and environmental variables of Guanting Reservoir.

SUN Yu-jiao1， CHEN Cheng1，2， DING Ai-zhong1*， ZHAO Xiao-hui1， ZHANG Hui-chun1（1.College of Water Science，Beijing Normal University， Beijing 100875， China；2.China International Engineering Consulting Corporation Resources and Environment Business Department， Beijing 100048， China）. China Environmental Science， 2015，35（5）：1547～1553

The water quality and environmental factors of Beijing Guanting Reservoir in different seasons were analyzed based on the characterization of the data from six sampling sites. Generally， the concentrations of the nutrients including carbon， nitrogen， and phosphorus were in the orders of: summer ＞ autumn ＞ spring ＞ winter， and the outbreaks of water-blooms occurred in summer and autumn. The water quality in the upstream （Gui River）， was better than that of the downstream （reservoir area）， especially in summer and autumn. In summer， the average concentrations of total carbon，total nitrogen， ammonia nitrogen， total phosphorus in upstream were 26.5， 0.95， 0.55， 0.077mg/L respectively， while that of downstream were 111.47， 4.27， 3.16， 0.25mg/L respectively. Microbial community of the water was analyzed employing PCR-DGGE technique. The result showed that bacterial community structures varied considerably between the upstream and the downstream. The upstream water behaved the higher level of bacterial community diversity and richer degree than that of downstream water serious bloom area. In addition， CANOCA software was used to explore the response relationship between microbial community and environmental factors in summer and autumn bloom periods. The result showed strong correlation in response of bacterial community structure with environmental factors （T， pH， DO，NFR， TP， Fe）. For upstream water， the better water quality was in the bacterial community structures mainly affected by the temperature and DO factor； while for the downstream， the poor water quality was with the bacteria community structures effected mainly by environmental factors of pH， TP and NFR.

Guanting Reservoir；water bloom；environmental factors；water quality；microbiological diversity

X703.5

A

1000-6923（2015）05-1547-07

孙寓姣（1975-），女，哈尔滨人，副教授，博士，主要从事环境微生态学及环境污染生物处理技术研究.发表论文30余篇.

2014-09-31

国家自然科学基金（51178048，51378064）；北京师范大学自主基金（2014KJJCB22）

* 责任作者， 教授， ading@bnu.edu.cn