苯并三唑和镉对斑马鱼肝脏的联合毒性效应

端正花，陈晓欧，刘灵丽，宫知远，李彩霞（.天津理工大学环境科学与安全工程学院，天津 300384；.新加坡国立大学生命科学学院，新加坡 7543）

苯并三唑和镉对斑马鱼肝脏的联合毒性效应

端正花1*，陈晓欧1，刘灵丽1，宫知远2，李彩霞2（1.天津理工大学环境科学与安全工程学院，天津 300384；2.新加坡国立大学生命科学学院，新加坡 117543）

采用转基因斑马鱼Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP）为模型，探讨了环境中苯并三唑及其衍生物（BTRs）与重金属镉对斑马鱼的单独与联合肝脏毒性效应.结果表明，0.001～0.1µmol/L CdCl2单独暴露使斑马鱼肝脏结合蛋白基因lfabp10a表达量增强，肝脏尺寸相对空白对照组显著膨大（P＜0.005），而1µmol/L CdCl2显著抑制斑马鱼lfabp10a的表达，肝脏尺寸相对空白对照组显著降低（P＜0.005）.苯并三唑（1H-BTR，1H-benzotriazole）相对CdCl2而言毒性较低，5 µmol/L 1H-BTR暴露时斑马鱼肝脏lfabp10a表达量增强（P=0.000）.联合暴露研究发现，1H-BTR能显著降低重金属镉对斑马鱼的肝脏毒性.因此，苯并三唑在环境污染物毒性评价中具有重要意义.

苯丙三唑；镉；转基因斑马鱼；联合毒性

苯并三唑及其衍生物（BTRs）在医药、农药、材料、生物染色剂和离子受体等多个领域具有广泛的潜在应用［1］.例如美国BTRs的平均总产量高达9000t/a［2］.由于其庞大的生产量及各种消费和工业产品广泛的使用，BTRs对环境的污染日益受到重视.Wang等［3］研究发现，美国和东亚地区的室内灰尘总BTRs的浓度大约在20～90ng/g，而中国室内灰尘中BTRs的浓度最高能达2000ng/g.世界范围内淡水和海洋环境中BTRs的总浓度约为0.08～200 µg/L［4］.BTRs的急性毒性较低，但是会产生各种慢性毒性［5］.研究发现1H-苯丙三唑（1H-benzotriazole，1H-BTR）具有发育毒性、致突变性和内分泌干扰特性，并被列为环境可疑致癌物［6］.然而目前国内外还没有关于此类化合物的环境污染和环境行为方面的系统研究报道［7］.

斑马鱼（Danio rerio）是环境毒理学中常用的标准生物模式种［8-9］，基因的保守性与人类基因组相比约为87％.在此基础上进一步发展的转基因斑马鱼技术不仅广泛应用于遗传学、发育生物学、细胞生物学、医学水产育种学等研究领域，在环境毒理学方面也有一定的价值.通过标示中枢神经系统的转基因斑马鱼Tg（nkx2.2a：EGFP）可以研究林丹等污染物的神经毒性［10］.Nguyen利用转基因斑马鱼建立了一种可诱导肝癌模型Tg（kras（V12）：EGFP）［11］，该模型可以显著表达外源化合物的致癌和抗癌性能，但是目前还未有环境致癌物检测的相关尝试.另外，某些特殊蛋白经过荧光标记后，可以在斑马鱼活体胚胎内将它们作为靶分子检测出来.例如通过标示Cyp1a基因的转基因斑马鱼Tg（cyp1a：EGFP）可以观察到TCDD暴露下Cyp1a基因在斑马鱼体内各个器官表达的影响［12］.转基因斑马鱼检测方法快捷简单，在荧光显微镜下观察计量即可，通常只需2min，而大多数传统的检测方法需要2d.这种检测可以在活体上直接进行，因此能够观察到在环境污染物干扰下某一个体在整个连续生命周期的发展变化，从而可以为其敏感性的研究提供直观证据.

肝脏是许多外源化学物毒作用的重要靶器官.依赖于转基因技术，建立标示肝脏发育的转基因斑马鱼品系Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP），以红色荧光标记肝脏lfabp10a基因，可以直观的在显微镜下观察到环境污染物暴露下lfabp10a基因在肝脏表达的部位和表达量，从而表征肝脏可能的尺寸变化［13］.斑马鱼肝型脂肪酸结合蛋白相关基因lfabp10a是脂肪酸结合蛋白家族（L-FABP）的重要成员之一，L-FABP不但可转运脂肪酸，为细胞生长提供能源及原材料，还可以结合和转运各种配体、参与细胞内的信号转导、影响有丝分裂，同时还具有抗氧化的功能.冯爱娟等［14］研究发现，L-FABP的表达增强与脂肪肝的发生有显著相关性.Zhang等［15］发现对乙酰氨基酚、利福平、阿司匹林等肝脏细胞损伤毒性物质的暴露与转基因斑马鱼品系Tg（lfabp10a： dsRed；elaA： EGFP）肝脏荧光量表达的降低存在显著的剂量-效应关系.

在实际环境中，环境污染物不可能单独存在，更多的是两种或多种污染物同时共存于环境中，它们作用于生物体时往往会发生与单一污染物作用完全不同的联合毒性作用.本研究以转基因斑马鱼Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP）为模型，拟建立快速而又特异性强的BTRs毒性检测技术，并探讨环境中BTRs与重金属离子的联合作用规律，以期为BTRs的健康风险和生态风险提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

苯丙三唑（1H-benzotriazole，1H-BTR）和氯化镉（CdCl2）（Sigma-Aldrich公司）.称取一定量的上述粉末，加入少量无水EDTA助溶（实际暴露溶液中EDTA的浓度不超过0.01％，经溶剂对照试验，此浓度对试验结果无影响），再溶于重组水［16］中，稀释到需要的浓度.根据这两种物质在环境中的实际浓度和预实验结果，本试验中1H-BTR的暴露浓度为0.2，1，5µmol/L，Cd2+的暴露浓度为0.001，0.01，0.1，1µmol/L.

实验室自培育成年野生斑马鱼和转基因斑马鱼Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP），雌雄比1：2，每日喂食活卤虫芽苗（Aremia mauplii，World Aquafedds，USA）1次，于（26±1）℃光照/黑暗（14h/10h）周期条件下培养1个月，开始采集鱼卵.饲养用水经生物过滤器过滤并充分曝气，pH值保持约8.0.

1.2 试验方法

将转基因斑马鱼种鱼Tg（lfabp10a： dsRed；elaA： EGFP）与野生型斑马鱼种鱼进行杂交，得到斑马鱼鱼卵.将一定浓度梯度的上述溶液加入到6孔细胞培养板中，每孔加入8mL试液，放20枚挑过的发育良好的受精卵，进行零时（卵产出并受精1h内）染毒.在人工气候箱培养6d，每2d换一次溶液，第6d在荧光显微镜下筛选各暴露组具有荧光表达的斑马鱼幼鱼.将各组筛选好的鱼进行麻醉、固定成相同的姿势，利用荧光显微镜（ZEISS Axiovert 200M）观察幼鱼中荧光表达，并利用数码相机（ZEISS AxiocCam HRC）下在相同放大倍数和曝光时间下拍照记录荧光表达量.利用Image J软件定量分析GFP的荧光表达量，比较各暴露组的荧光表达差异.

1.3 统计分析

每个实验组设3个平行样.采用SPSS 13.0软件，组内进行student-t检验，并用标准误差SD表示；组间用one way-ANOVA检验，P＜0.05表示有显著差异.

2 结果与讨论

2.1 CdCl2单独暴露对斑马鱼仔鱼肝脏发育的影响

图1 1H-BTR和CdCl2诱导下斑马鱼肝脏lfabp10a的荧光表达Fig.1 The fluoresce expressions of lfabp10a in zebrafish liver induced by 1H-BTR and CdCl2红色显示部分为斑马鱼肝脏lfabp10a的荧光量

如图1所示，外源化合物对转基因斑马鱼仔鱼肝脏主要有两个方面的影响，一是使斑马鱼仔鱼肝脏处荧光量增大，表明肝型脂肪酸结合蛋白相关基因lfabp10a表达量增强、肝脏尺寸膨大，这与肝组织发生炎症从而充血、水肿的现象相一致，可提示其发生肝脏炎症的风险性增强；另一方面斑马鱼仔鱼肝脏处荧光量减弱，表明肝型脂肪酸结合蛋白相关基因lfabp10a表达量下降、肝脏尺寸减小，提示其具有抑制肝脏发育和肝脏细胞损伤毒性.

不同浓度CdCl2暴露下，如图2所示，斑马鱼肝脏表现为低浓度（0.001，0.01，0.1µmol/L）lfabp10a表达量增强，肝脏相对空白对照显著膨大（P＜ 0.005）；而有意思的是在高浓度CdCl2暴露下（1µmol/L）斑马鱼肝脏发育受到抑制，肝脏尺寸相对空白对照显著降低（P＜0.005）.通常认为高剂量的CdCl2会导致胚胎发育延缓及异常［17-18］，这与本研究发现的1µmol/L CdCl2抑制斑马鱼肝脏发育的结论相一致.低剂量CdCl2暴露使斑马鱼肝脏变得膨大，可以推导低剂量CdCl2会诱导斑马鱼肝脏发生炎症作用.任亚萍等［19］也发现低剂量CdCl2会导致小鼠大量肝细胞水样变性，炎症细胞聚集明显.

图2 CdCl2对斑马鱼的肝脏毒性Fig.2 Hepatotoxicity of CdCl2in zebrafish liver a-与对照组比，P＜0.05

2.2 1H-BTR单独暴露对斑马鱼仔鱼肝脏发育的影响

如图3所示，1H-BTR相对CdCl2而言毒性较低，低浓度（0.2和1µmol/L）1H-BTR暴露时，无显著毒性效应，只在5µmol/L暴露时表现为lfabp10a表达量增强、肝脏膨大（P=0.000），并且剂量-效应作用显著（R2=0.903）.

鉴于BTRs在水环境中高溶解度（高达28g/L），及其在水环境中的大量暴露（如紫外防晒剂、防冻剂等可以直接进入环境水体，也能够通过污水处理厂间接进入水环境中），并且BTRs稳定性较高、难降解、在环境中将会长期存在，BTRs的水生生物毒性引起了极大的关注.但是目前只有少量报道其对水生生物（绿藻、大型蚤、斑马鱼等）的急性毒性效应［20］，观察的指标主要为半致死浓度（LC50）和半效应浓度（EC50，如对大型蚤繁殖的半数抑制率［20］），作用的浓度范围为mg/L级.目前为止仅有一篇文献对其发育毒性进行研究，即苯并三唑对玻璃海鞘肠（Ciona Intestinalis）48h孵化率抑制的最低无效应浓度（LOEC）为32mg/L［21］.BTRs在实际水生环境中都以较低剂量形式存在（µg/L），很少有其慢性毒性的相关报道.

图3 1H-BTR对0.1µmol/L CdCl2斑马鱼肝脏毒性的影响Fig.3 The influence of 1H-BTR on the toxicity of 0.1µmol/L CdCl2in zebrafish liver

本次研究发现5 µmol/L（约0.5mg/L）1HBTR亚慢性暴露可显著导致斑马鱼肝型脂肪酸结合蛋白相关基因lfabp10a表达增强、肝脏尺寸变大.刘世博也发现经过21d苯并三唑暴露后，蓝子鱼肝体比指数随暴露浓度增加而增加［22］.因此，环境中BTRs对人体健康存在潜在威胁.

2.3 CdCl2和1H-BTR联合暴露对斑马鱼仔鱼肝脏发育的影响

根据1H-BTR和CdCl2单独暴露对斑马鱼仔鱼肝脏毒性效应，分别以0.1和1µmol/L CdCl2为研究对象，在其基础上分别加入上述浓度梯度（0.2，1，5µmol/L）的1H-BTR，研究其联合暴露效应.

在0.1µmol/L CdCl2基础上加入不同浓度梯度的1H-BTR，如图3所示，这两种物质在联合暴露浓度范围内都表现为促使斑马鱼仔鱼肝脏膨大、诱导lfabp10a基因表达作用.但是随着联合暴露中1H-BTR浓度增大，促使斑马鱼肝脏膨胀的毒性反而降低，表现为负相关关系（R2=0.833）.在最高联合暴露组0.1µmol/L CdCl2/5µmol/L 1H-BTR，斑马鱼仔鱼的肝脏尺寸已与对照无显著差异（P=0.159）.因此0.1µmol/L CdCl2和1H-BTR在联合暴露中表现为拮抗作用.

试验进一步在1µmol/L CdCl2基础上加入不同浓度梯度的1H-BTR.根据单独暴露结果，1µmol/L CdCl2表现为抑制肝脏lfabp10a表达作用，1H-BTR在暴露浓度范围内都表现为诱导斑马鱼lfabp10a表达作用.如图4所示，联合暴露中斑马鱼肝脏都继续表现为lfabp10a表达量减弱、肝脏尺寸降低现象，这与CdCl2单独暴露的结果一致.但是随着联合暴露中1H-BTR浓度增大，斑马鱼肝脏尺寸降低的程度减小，并且存在剂量-效应关系（R2=0.884）.从这个角度来看，1µmol/L CdCl2和1H-BTR在联合暴露中也表现为拮抗作用.

图4 1H-BTR对1µmol/L CdCl2斑马鱼肝脏毒性的影响Fig.4 The influence of 1H-BTR on the toxicity of 0.1µmol/L CdCl2in zebrafish liver

水体中重金属的毒性会受到非生物因素的制约，如温度、pH值、游离离子浓度、有机物的络合作用等.环境中重金属具有强烈的急性毒性、及“三致”等各种慢性毒性［23］.大部分工作认同有机络合实际可以大大降低重金属的毒性，因为金属与有机试剂的络合降低了游离形态的浓度［24］.BTRs芳香环上的氮硫杂原子上有孤对电子、易于与各种重金属离子或受体结合发生螯合作用从而使其毒性降低.这与本试验研究发现相一致，即1H-BTR能显著降低0.1和1µmol/L CdCl2对斑马鱼仔鱼肝脏毒性.陈敏等［25］也发现加入螯合剂N-对羟甲苯甲基-D-葡萄糖二硫代氨基甲酸钠（HBGD）后，使得镉对小鼠睾丸的毒性显著下降.

动物体的不同组织对某种重金属具有高度选择性，肾脏和肝脏由于可以快速大量合成金属硫蛋白使重金属得以大量蓄积，所以称为重金属蓄积的重要靶器官［26］.由于对BTRs研究的严重不足，目前国内外没有BTRs在生物体内蓄积分布和毒性靶器官研究的任何报道，很难推测BTRs和重金属联合毒性作用效果是否的确是由于这两者之间的螯合作用产生的.而这两类物质在环境中广泛分布并长期存在，因此对于其联合毒性的研究有待加强.

3 结论

3.1 0.1µmol/L CdCl2单独暴露使斑马鱼肝型脂肪酸结合蛋白相关基因lfabp10a表达量显著增强，增大斑马鱼肝脏炎症的风险；1µmol/L CdCl2抑制lfabp10a的表达，证明其肝脏发育抑制作用.

3.2 1H-BTR相对CdCl2毒性较低，5µmol/L暴露时导致斑马鱼肝型脂肪酸结合蛋白相关基因lfabp10a表达量增强.

3.3 1H-BTR和CdCl2对斑马鱼的肝脏毒性具桔抗作用.

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Joint toxicity of benzotriazole and cadmium to zebrafish liver.

DUAN Zheng-hua1*，CHEN Xiao-ou1，LIU Ling-li1，GONG Zhi-yuan2，LI Cai-xia2（1.School of Environmental Science and Safety Engineering，Tianjin University of Technology，Tianjin，300384，China；2.Department of Biological Sciences，National University of Singapore，117543 Singapore）.China Environmental Science，2015，35（6）：1872～1876

Transgenic zebrafish Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP）was used to explore the single and joint hepatotoxicities of benzotriazole and its derivatives（BTRs）and cadmium in the environment.The results showed that，the expression of liver-type fatty acid binding protein related gene lfabp10a in zebrafish was up-regulated under the exposure of 0.001 to 0.1µmol/L CdCl2，and the size of the liver was significant enlarged than that in the control group（P＜0.005）.But the expression of lfabp10a in zabrafish liver was inhibited by 1 µmol/L CdCl2，and the liver size was apparently decreased（P＜0.005）.Toxicity of 1H-BTR（1H-benzotriazole）was much lower when compared with that of CdCl2，and lfabp10a expressed in zebrafish liver was up-regulated under exposure of 5µmol/L 1H-BTR.The hepatotoxicity of CdCl2was significantly reduced by 1H-BTR（P=0.000）in their combined exposure.Therefore，benzotriazole plays an important role in the evaluation of the toxicities of environmental pollutants.

benzotriazole；cadmium；transgenic zebrafish；joint toxicity

X171.5

A

1000-6923（2015）06-1872-05

端正花（1981-），女，江苏镇江人，讲师，博士，主要从事环境生物标志物的筛选方向的研究.发表论文10余篇.

2014-11-10

天津市2013年优秀博士后国际化培养计划；天津市教委重点调研课题（JWDY-20142015）

* 责任作者，讲师，duanzhenghua@mail.nankai.edu.cn