一株携带EGFP基因的重组伪狂犬病毒变异株的构建

童 武，郑 浩，梁 超，刘 飞，曹艳云，李 林，田 青，郑旭晨，单同领，李国新，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·研究论文·

一株携带EGFP基因的重组伪狂犬病毒变异株的构建

童 武，郑 浩，梁 超，刘 飞，曹艳云，李 林，田 青，郑旭晨，单同领，李国新，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

本研究运用同源重组的方法，在伪狂犬病毒 （Pseudorabies virus， PRV）变异株 PRV JS-2012 基础上，构建了一株携带增强型绿色荧光蛋白基因的标记重组伪狂犬病毒，命名为rPRV JS-2012-EGFP。经PCR方法鉴定及荧光显微镜观察分析，结果表明重组病毒构建成功，并能在感染细胞中稳定表达绿色荧光蛋白。生长曲线和空斑试验结果显示，rPRV JS-2012-EGFP与亲本株 PRV JS-2012在体外具有相似的生长特性。将 rPRV JS-2012-EGFP 毒接种14日龄PRV阴性仔猪，能使实验猪100%发病，病死率高达40%，表明rPRV JS-2012-EGFP是一株具有强致病力的标记伪狂犬病毒变异株，在伪狂犬病毒变异株致病机制研究中具有一定的使用价值。

伪狂犬病毒；同源重组；重组病毒；绿色荧光蛋白

伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种烈性传染病［1］。PRV属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科水痘病毒属，其基因组为线状双链DNA，长约150 kb，由长独特区（UL）、短独特区（US）及US两侧的内部重复序列与末端重复序列组成，编码70多种蛋白［2-5］。伪狂犬病最早发现于美国，中国20世纪60年代初猪群中也出现了PRV流行。猪是PRV的天然宿主、贮存者和传播者［1，6］，PRV可感染各个年龄段的猪，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率［7］，种猪不育，严重影响着我国养猪业的健康发展。自2011年以来，我国猪群中出现了PRV变异株，且该变异株毒力较经典PRV毒力明显增强［8-12］。

PRV变异株对仔猪的致病机制，特别是其在猪体内的传播途径和组织分布，至今并不清楚。本研究利用同源重组技术构建了一株携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent profei，EGFP）标记的重组伪狂犬病毒，便于直接通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白来判定病毒的存在。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞 伪狂犬病毒变异株（PRV JS-2012）、BHK-21 细胞、Vero 细胞均由上海兽医研究所猪病实验室保存。

1.2 试剂、实验猪 LA Taq DNA 聚合酶、dNTP mix，2×GC Buffer I、 DNA Marker DL-2000 等购自宝生物工程（大连）有限公司；pEGFP-N1、pEGFP-C3和pBluescript SK（+） 购自上海基音生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α 感受态购自天根化科技（北京）有限公司；胎牛血清、MEM 和DMEN为Invitrogen 公司产品；AseI、SacI、XhoI、ScaI 和 T4 DNA 连接酶为NEB公司产品；Fugene HD 转染试剂为Promega 公司产品；胶回收试剂盒购自OMEGA 公司；阴性实验猪购自南京某猪场。

1.3 引物 参照 PRV JS-2012 的基因序列，设计了分别用于扩增重组左臂和重组右臂的两对引物：JS+EGFP-LF/JS+EGFP-LR和JS+EGFP-RF/ JS+EGFP-RR。同时，设计一对引物 JS gG 鉴定 up / JS gG 鉴定down ，用于鉴定绿色荧光蛋白是否插入。引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成，序列如表1。

表 1 用于重组臂的扩增和重组病毒鉴定的引物Table 1 The primers for amplifying the reorganization arms and identifying the recombinant virus

1.4 转移载体的构建 通过PCR扩增出位于PRVJS-2012基因组中121 118至122 624位碱基和122 634至124 143位碱基的两条片段，用作同源重组的左、右重组臂，分别位于插入位置两侧（图1）。同时，通过内切酶酶切，从pEGFP-C3质粒中切出CMV启动子-EGFP基因片段，从pEGFP-N1质粒中切出SV40 polyA信号序列片段，并将左重组臂-CMV启动子-EGFP基因-SV40 polyA信号序列-右重组臂依序组装于pBluescript SK（+） 载体中，获得重组转移载体pBG-EGFP。

1.5 病毒核酸的提取 将PRV JS-2012株接种融合单层的BHK-21细胞，待70%～80%的细胞产生病变，将细胞刮下，并将细胞液移入50 mL离心管，1500×g离心 5 min，弃上清，用 TNE 溶液将沉淀细胞重悬。以酚-氯仿法从感染细胞中提取总DNA ，并溶于TE中，于 －30℃保存备用。

1.6 重组病毒的构建 生长于35 mm培养皿中的BHK-21细胞，其密度达到70%～85%时，参照说明书，用Fugene HD 转染试剂将 1.5 提取的 DNA 和1.4中构建的转移载体 pBG-EGFP 共转染至BHK-21细胞中。转染后的细胞置于37℃、CO2培养箱中培养，36 h后出现细胞病变，收获上清。将收集的病毒稀释后，接种融合单层的 Vero 细胞。感染后1 h，吸去感染液，在细胞上铺加含 1% 琼脂糖和 2% FBS 的 MEM 培养基，室温凝固。将接种细胞移入 CO2培养箱中培养，60 h后置于荧光显微镜下观察，标记并挑取有绿色荧光的蚀斑，置于DMEM中。将冻融的蚀斑液接种Vero细胞，进行下一轮蚀斑纯化，直至所有蚀斑均有绿色荧光。

1.7 重组病毒的PCR鉴定 利用 DNA 提取试剂盒提取已纯化的重组病毒 DNA，以该DNA作为模板，用 JS gG 鉴定 up / JS gG 鉴定 down 引物进行 PCR 鉴定。PCR 体系为20μL:2×GC BufferⅡ 10μL、dNTP Mix （ 2.5mmol/mL each） 2 μL、JS gG 鉴定 up0.5μL（10pmol/μ L）、JS gG 鉴定 down 0.5μL（10pmol/μL）、LA-Taq 0.5μ L、ddH2O 4.5 μL、 DNA2 μL。PCR 反应条件: 94℃预变性 5min；94℃变性 30s，66℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，循环 35 次；最后72℃延伸 10 min。PCR产物进行 1% 琼脂糖电泳后，在凝胶成像仪中观察。1.8 重组病毒的生物学特性分析 将重组病毒液稀释成10-1～10-10，分别接种至 96孔培养板中长成融合单层的 Vero 上，每个稀释度接种 8 孔，培养板最后两列孔接种稀释液作对照，置37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，96 h后观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50［12］。重组病毒和其亲本毒均以0.01MOI的毒量接种Vero 细胞，分别在接毒后不同的时间点 （12、24、36、48、60、72、84、96 h） 收取细胞上清液，分别进行病毒的TCID50测定，根据测定结果绘制生长曲线。

将重组病毒和亲本毒均以103TCID50/ mL 分别感染 六 孔板中的1孔细胞，于37℃、5% CO2培养箱中吸附2h，分别加入等体积的琼脂糖和2×MEM，充分混合至温度适合时每孔加入混合液2mL；置于4℃待覆盖层完全凝固，将之倒扣，37℃、5% CO2培养箱中培养4d；经甲醛固定，结晶紫染色后在合适的病毒感染量时即可见典型的空斑形成。

1.9 重组病毒的毒力测定 14日龄阴性仔猪 15 头，随机分为3组，每组5头。第1组分别接种PRV JS-2012强毒 106.0个 TCID502 mL；第2组分别接种重组病毒106.0个 TCID502 mL；第3组分别接种DMEM 2mL。攻毒后每天监测试验猪的体温，并观察临床症状。

2 结果

2.1 转移载体活性验证 将1.4中构建好的转移载pBG-EGFP转染至BHK-21细胞24h后，置于荧光显微镜下观察。结果显示，转移载体中的绿色荧光蛋白在BHK-21细胞中高效表达，结果见图2。

图1 增强型绿色荧光蛋白基因插入位置示意图Fig. 1 Insert sketch map of enhanced green fluorescent protein （ EGFP ）

图2 转移载体 pBG-EGFP 活性验证Fig. 2 The validation activity of transfer vector pBG - EGFP

2.2 重组病毒的构建 将1.5中提取的DNA和1.4中构建的转移载体 pBG-EGFP 共转染至生长良好的BHK-21细胞中，置37℃、CO2培养箱中培养，36h后出现细胞病变，收获上清。将病毒上清稀释后，接种融合单层的Vero 细胞做蚀斑纯化。经过4轮蚀斑纯化后得到了较纯的重组病毒，该重组病毒所形成的蚀斑在荧光显微镜下均可见绿色荧光（图3）。将该重组病毒命名为rPRV JS-2012-EGFP。

图3 rPRV JS-2012-EGFP 病毒的蚀斑纯化Fig.3 Plaque purification of rPRV JS-2012-EGFP

2.3 rPRVJS-2012-EGFP病毒的PCR鉴定 利用DNA提取试剂盒提取rPRV JS-2012-EGFP毒及亲本毒 PRV JS-2012 的 DNA，参照 1.7 中的方法进行PCR 扩增。结果显示 PRV JS-2012 毒扩增出 819bp的特异性条带，rPRV JS-2012-EGFP扩增出 2300bp左右的条带（图4）。rPRV JS-2012-EGFP 插入的绿色荧光蛋白的大小为1500 bp左右，与上述PCR结果相符，证实rPRV JS-2012-EGFP构建成功。

2.4 rPRV JS-2012-EGFP 病毒的生物学特性分析 将rPRV JS-2012-EGFP 毒液稀释为10-1～10-10，参照1.8中的方法测定病毒的TCID50，结果表明rPRV JS-2012-EGFP的TCID50为107.5/mL。将rPRV JS-2012-EGFP 毒和其亲本毒 PRV JS-2012 都以 0.01MOI 的毒量接种Vero 细胞，在接毒后每隔 12 h 分别收取细胞上清液，并测定TCID50，根据测定结果绘制生长曲线。结果显示 rPRV JS-2012-EGFPE 毒和亲本毒PRV JS-2012 的生长曲线基本一致（见图5）。空斑形成结果显示， rPRV JS-2012-EGFP 毒和其亲本毒PRV JS-2012 在 Vero 细胞上所形成的蚀斑大小与形态完全一致（见图6）。

图4 rPRV JS-2012-EGFP 的 PCR 鉴定结果Fig.4 PCR detection result of rPRV JS-2012-EGFP

图5 重组病毒 rPRV JS-2012-EGFP 及其亲本毒在Vero 细胞上的多步生长曲线Fig.5 Growth curve of rPRV JS-2012-EGFP and its parental viruses on Vero cells

图6 rPRV JS-2012-EGFP 及亲本毒的蚀斑形态Fig.6 Plaque morphology of rPRV JS-2012-EGFP and its parental viruses

2.5 rPRV JS-2012-EGFP病毒的毒力测定 PRV JS-2012接种组实验猪在攻毒后d 2体温升至 41℃ 以上，攻毒后d 4出现死亡，d 5全部死亡。rPRV JS 2012-EGFP接种组在攻毒后d2体温均升至41℃以上，持续 41℃高烧 4d后体温开始下降，攻毒后d8和d9各死亡1头猪（图7和图8）。

图7 rPRV JS-2012-EGFP和 PRVJS-2012攻毒后猪的体温变化Fig.7 Body temperature changes of piglets post infection with rPRV JS-2012-EGFP and PRV JS-2012

图8 攻毒后各组猪不同时间的存活情况Fig.8 Mortality of piglets post infection with rPRV JS-2012-EGFP and PRV JS-2012

3 讨论

同源重组技术是一项很经典的基因工程技术，在伪狂犬病毒上应用的非常成熟。国内很多科研工作者通过该方法均可有效的在病毒基因组中插入，替换缺失目的基因［13-15］。

本研究在伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012的基础上，利用同源重组技术，构建了一株含绿色荧光标记的重组伪狂犬病毒变异株rPRV JS-2012-EGFP。为了保持PRV原有的特性，本研究将绿色EGEP插在gG基因后面。gG蛋白是PRV的非结构蛋白，成熟的PRV病毒粒子中不含gG蛋白，gG蛋白主要分布于感染细胞的培养基中。gG蛋白对于病毒的毒力、吸附、穿入以及细胞间的扩散均是非必需的［16］。本研究中插入的绿色荧光蛋白携有独立的CMV启动子及SV40 polyA终止序列，尽可能的不影响其他基因的功能。经生物学特性验证rPRV JS-2012-EGFP 毒与亲本毒PRV JS-2012基本一致，且动物实验结果表明rPRV JS-2012-EGFP毒仍然是一株强毒，对仔猪仍具有很强的致病力。

病毒感染仔猪后用rPRV JS-2012-EGFP ，定期剖杀，取组织脏器涂片后，通过荧光显微镜观察即可了解组织脏器的病毒感染情况。本研究结果为PRV变异株感染仔猪的机制及病毒在猪体内的感染途径，提供了直观、简便、快捷的手段。

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CONSTRUCTION OF A RECOMBINANT PSEUDORABIES VIRUS VARIANT EXPRESSING EGFP

TONG Wu， ZHENG Hao， LiANG Chao， LIU Fei， CAO Yan-yun， LI Lin， TIAN Qing，
ZHENG Xu-chen， SHAN Tong-ling， LI Guo-xin， TONG Guang-zhi（Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241，China）

An enhanced green fluorescent protein （EGFP） expression cassette was homologously recombined into the genome of a virulent Pseudorabies virus （PRV） variant strain PRV JS-2012， generating a recombinant PRV strain rPRV JS-2012-EGFP. The insert of EGFP gene were confirmed by PCR， and green fluorescence proteins were stably expressed in the cultured cells infected with rPRV JS-2012-EGFP by green fluorescence microscopy analysis. The assays of growth curve and plaque morphology revealed that rPRV JS-2012-EGFP showed similar virological properties to its parent strain PRV JS-2012. 14-day old piglets free of PRV antibodies were inoculated with rPRV JS-2012-EGFP. The morbidity of the infected piglets reached 100%， and the mortality reached 40%. These results showed that rPRV JS-2012-EGFP was a virulent marker PRV and could be utilized to study pathogenic characterization of PRV variant.

Pseudorablies virus； homologous recombination； recombinant virus； green fluorescent protein

S852.659.1

A

1674-6422（2015）04-0001-07

2015-05-15

上海市自然科学基金项目（14ZR1448900）；上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2015）第1-7号）；中央科研院所公益性基础科研业务费项目（2014JB02）；国家生猪现代产业技术体系项目（CARS-36）

童武，男，硕士，实习研究员，主要从事猪病研究

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn