火龙果溃疡病菌拮抗细菌的鉴定和发酵培养基优化①

陈静等

摘 要 采用对峙培养法从来自土壤的136株细菌中筛选得到对火龙果溃疡病菌有拮抗作用的菌株HTN-5，抑菌带宽9.0 mm。通过形态学、生理生化特性和16s rDNA序列分析，将拮抗菌HTN-5初步鉴定为皮氏类芽孢杆菌Paenibacillus peoriae。从8种培养基中筛选出IFFI培养基最有利于菌株HTN-5形成抑菌活性物质，正交试验优化其成分，得最优配方为：牛肉膏2.50 g/L，蛋白胨10.00 g/L，葡萄糖12.50 g/L，乳糖10.00 g/L，酵母膏2.50 g/L，氯化钠5.00g/L，pH 6.8。

关键词 火龙果溃疡病 ；皮氏类芽孢杆菌 ；拮抗菌 ；培养基优化

分类号 S667.9 ；S436.68

火龙果（Hylocereus spp.）是一种热带、亚热带水果，属于仙人掌科Cactaceae量天尺属Hylocereus植物。火龙果原产中美洲，20世纪90年代引入我国，在广东、广西、海南、福建、云南和贵州等地广泛种植，种植面积约1.3万hm2。

近年来，火龙果遭受多种病害的侵袭[1]，其中，溃疡病是危害最为严重的病害，在广东、广西等地导致许多果园丢荒，严重威胁火龙果的大面积种植和生产。火龙果溃疡病是由新暗色柱节孢Neoscytalidium dimidiatum引起，主要危害茎，在高温高湿下出现茎杆腐烂和果实开裂[2-3]，也可引起果肉褐腐或黑腐[4-5]。室内毒力测定显示，许多化学药剂对火龙果溃疡病菌有很好的抑制作用[6]，但在生产上还没有行之有效的方法控制火龙果溃疡病发生和蔓延。

笔者研究了一株从发病果园及其周围土壤中分离筛选到对火龙果溃疡病菌具有拮抗作用的细菌，对其进行鉴定和发酵培养基成分的优化，以期为开发防治火龙果溃疡病的生防制剂提供依据。

1 材料和方法

1.1 火龙果溃疡病菌

采用病组织分离法[7]，从具有火龙果溃疡病典型症状的组织上分离得到，经致病性测定，确定为病原菌，通过形态学和分子生物学鉴定为新暗色柱节孢N. dimidiatum[3]，菌种保存在广东海洋大学农学院微生物学实验室。

1.2 拮抗菌的分离筛选

分离：采用稀释平板法从样品分离细菌。将从广东湛江地区发病果园及其周围土壤中采集样品，稀释105倍，沸水浴5 min后，取200 μL稀释液涂布于冷却的PDA培养皿上，28℃培养48～64 h。

筛选：采用平板对峙法进行筛选。将火龙果溃疡病菌接种到PDA平板上28℃培养3 d，用打孔器取直径6.0 mm 的菌饼接种到PDA培养皿中央。用接种环挑取细菌接种到距菌饼3 cm处，每个菌饼周围接种4 个细菌单菌落，28℃黑暗培养，3 d后观察抑菌带的形成，记录抑菌带的宽度和细菌菌落直径，计算抑菌带的宽度与细菌菌落直径的比值，比值越大，抑菌效果越好。将对火龙果溃疡病菌有拮抗作用的细菌转接到PDA平板，划线分离纯化，在4℃冰箱中保存。

复筛：将有抑菌活性的细菌再次进行平板对峙试验，测定其抑菌作用，挑取抑菌效果最好的菌株进行鉴定及产抗菌物质培养基的优化。

1.3 产抑菌活性物质培养基筛选

供试培养基有（1）BPDB：马铃薯200 g、牛肉膏20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；（2）改良BPDB：马铃薯200 g、牛肉膏20 g、蛋白胨7 g、葡萄糖20 g、玉米粉7 g、水1 000 mL、pH自然；（3）YPAD：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；（4）NYDA：牛肉膏8 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；（5）BPY：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.2；（6）玉米粉培养基：玉米粉5 g、蛋白胨0.1 g、葡萄糖1 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；（7）IFFI：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、乳糖尿5 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.8；（8）NA：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然。

将经活化后的拮抗菌用无菌水配成106～107 CFU/mL的菌悬液，按1%的接种量接种到装有20 mL BPDB 培养液的50 mL三角瓶中，在转速为150 r/min 振荡培养箱中28℃下黑暗培养24 h，作为种子液。按1%的接种量将种子液分别接种到装有供筛选培养基的50 mL三角瓶中，装瓶量为20 mL，150 r/min 振荡培养72 h 后，经12 000 r/min，离心15 min，取上清液，用0.22 μm细菌过滤器过滤除菌，经无菌检验后得到无菌发酵液。

牛津杯法测定无菌发酵液的抑菌活性。火龙果溃疡病菌在PDA平板上培养7 d后，用无菌水将孢子洗后加入PDA培养基中，制备含菌量为104～105个孢子/mL的带菌PDA平板。在每个平板中放4个牛津杯，加200 μL无菌发酵液至牛津杯，28℃培养72 h后，测量抑菌圈大小，筛选得到最有利于产抑菌活性物质的培养基进行成分优化。每个处理重复3次。

1.4 产抑菌活性物质培养基优化

从8种供试发酵培养基中筛选出最有利于拮抗菌产抗菌活性物质的培养基IFFI，采用L16（45）正交试验进行培养基成分优化（表1）。培养基接种、发酵条件和发酵液抑菌活性测定同1.3，确定最佳发酵培养配方。

1.5 拮抗菌的鉴定

形态学和生理生化特性：参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]与《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]。

16s rDNA序列分析：16s rDNA序列扩增引物为细菌鉴定通用引物（27f：5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3和1512R：5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3）[10]。将保存的拮抗菌划线接种PDA平板，用无菌牙签挑取单菌落进行菌落PCR[11]。PCR反应体系采用TaKaRa公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2试剂盒，反应体积50 μL。PCR扩增程序：98℃预变性5 min；98℃变性1 min，56 ℃复性30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将所得序列在GenBank进行BLAST分析，选取与病菌序列同源性高及近缘种菌株序列，用MEGA 6.0[12]软件构建系统发育树，并用Bootstrap进行自举检验，1 000次重复。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的分离及筛选

从广东省湛江地区发病果园及其周围土壤中采集的样品中分离得到136株细菌，平板对峙试验结果显示，其中12株对火龙果溃疡病菌有抑制作用，通过复筛，7菌株仍有很好的抑制作用（表2）。

从表2可以看出，细菌HTN-5抑菌效果最好，在初筛和复筛时，均形成抑菌带宽9.00 mm，抑菌活性稳定。复筛时，抑菌带宽与菌落直径比值最大为1.64。

2.2 产抑菌活性物质培养基筛选

将HTN-5接种到8种供试发酵培养基中，无菌发酵液的拮抗活性顺序为：IFFI>NYDA>YPAD>改良BPDB> BPDB>玉米粉培养基>BPY>NA。对应的抑菌圈直径分别为21.00、20.50、18.50、17.50、15.50、13.00、11.50和9.50 mm。用IFFI发酵的发酵液拮抗效果最好，故以IFFI作为最适发酵培养基进行含量优化试验。

2.3 产抑菌活性物质培养基成分优化

对拮抗效果最好的发酵培养基IFFI进行L16（45）正交试验，改变蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乳糖5个因素的用量，用L16（45）正交试验设计优化产抗菌活性物质的培养基成分，试验结果见直观分析表（表3）。

从表3可以看出，各因素的极差排序为牛肉膏>蛋白胨>葡萄糖>乳糖>酵母膏，表明牛肉膏为影响拮抗菌HTN-5产抗菌活性物质的最主要因素，发酵最佳培养基配方为牛肉膏2.50 g/L，蛋白胨10.00 g/L，葡萄糖12.50 g/L，乳糖10.00 g/L，酵母膏2.50 g/L，氯化钠5.00 g/L，pH 6.8。经检验，无菌发酵液的抑菌圈直径为23.30 mm，抑菌活性提高了11.0%，更有利于生产抗菌活性物质。

2.4 拮抗细菌的形态学及生理生化鉴定

形态学特征：在PDA培养基，菌株HTN-5菌落圆形突起，乳白色，有光泽，不透明，具有粘性，边缘整齐，培养72 h可活跃扩展为“运动的菌落”（图1A）。菌体细胞杆状，成对排列，G+（图1B），0.33 μm×1.87 μm （n>50）；可形成内生芽孢，芽孢囊膨胀，芽孢椭圆形。

生理生化特征（表4）：该菌产生过氧化氢酶，可分解葡萄糖和甘露醇，能够液化明胶和水解淀粉；在pH 5.7和6.8的营养肉汤中能生长；在含2%、5%和7% NaCl的培养基中生长；在20、30、37和41℃下可生长。V.P.反应、肌醇降解、利用葡萄糖产气、苯丙氨酸脱氨酶和卵磷脂酶测定、吲哚产生试验，硝酸盐还原反应均为阴性；在含10% NaCl的培养基中不生长；在4、45和65℃下不可生长。

16s rDNA序列分析：菌株HTN-5的16s rDNA序列经PCR扩增得到1 039 bp的片段（KT274704），在GenBank中进行Blast比对，菌株HTN-5的16s rDNA序列与皮氏类芽孢杆菌Paenibacillus peoriae 模式菌株DSM 8320（HG794409），多粘类芽孢杆菌P. polymyxa 模式菌株DSM 36（HG324071）和P. brasilensis模式菌株ATCC BAA-413（AF273740）的序列同源性均为99%。从GenBank中选取类芽孢杆菌属Paenibacillus的近缘种序列，Mega 6.0 软件进行Clustal比对后，采用最大似然数法（Maximum Likelihood method）构建系统发育树（图2）， HTN-5与P. peoriae DSM 8320聚集在同一个分枝上，而与P. polymyxa DSM 36和P. brasilensis ATCC BAA-413位于不同分枝上。综合形态学、生理生化特性以及系统发育分析，将拮抗菌HTN-5初步鉴定为皮氏类芽孢杆菌Paenibacillus peoriae[13-16]。

3 讨论与结论

火龙果溃疡病是一个世界性的病害，在马来西亚、以色列、墨西哥、美国和尼加拉瓜等火龙果种植区均有发生，严重危害火龙果的产量和质量。火龙果溃疡病菌在自然界中通过无性孢子蔓延和传播，在高温高湿条件下容易爆发。虽然毒力测定结果显示有一些化学药剂对其有很好的抑制作用，有希望控制该病的发生和蔓延，但是在田间并没有表现出很好的防治效果，因此，应用拮抗菌防治火龙果溃疡病是一条很好的途径。

皮氏类芽孢杆菌P. peoriae（早期为Bacillus peoriae）是一个土壤习居菌，最早于1993年从土壤根际中分离，Heyndrickx等对Bacillus peoriae和B. lautus进行修订时确定的一个新组合种[13]。皮氏类芽孢杆菌P. peoriae对多种植物病原菌有很好的拮抗作用，产生如细胞外蛋白水解酶和几丁质酶等抗菌物质，并且能够固氮[17-18]，是一个潜在的生物防治菌。本研究筛选到一株细菌菌株HTN-5，对火龙果溃疡病原菌具有明显的拮抗作用，通过形态学、生理生化特性以及16s rDNA序列分析，将拮抗菌HTN-5初步鉴定皮氏类芽孢杆菌Paenibacillus peoriae。目前，有关皮氏类芽孢杆菌P. peoriae作为生物防治菌的研究报道较少，因此有必要深入研究该菌的抑菌机制、在环境的定殖以及产生抗菌活性物质的主要成分等，以期更好开发利用皮氏类芽孢杆菌P. peoriae。

皮氏类芽孢杆菌P. peoriae菌株HTN-5对火龙果溃疡病菌有稳定的抑制作用，具有一定的开发应用前景。本研究对其产抗菌活性物质的发酵培养基成分进行了优化，获得了最佳发酵培养基配方，为开发菌株HTN-5防治火龙果溃疡病的生防药剂奠定一定的基础。

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