探讨Notch信号通路对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞mRNA影响

孟凡兵　范东旭　刘丽　金松

[摘要]目的：探讨Notch信号通路对体外培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的mRNA水平的影响。方法：本课题从不同梯度浓度v-分泌酶抑制剂（DAPT）干预Notch信号通路后对DM大鼠VSMCs基因影响进行论述。结果：通过实时定量PCR方法分析得出，加γ-分泌酶抑制剂（DAPT）的培养基的DM大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）溶解温度峰值Tm进行检测得出：溶解曲线呈单峰，溶解温度在86.0℃-84.0℃之间，溶解温度变化小，表明为特异性扩增。结论：实验结果显示DAPT干预Notch信号通路后，对体外培养的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趋势，复制率下降，使其溶解温度峰值前移，溶解曲线呈单峰，将会导致进一步细胞凋亡。

[关键词]PCR；糖尿病大鼠；DAPT；血管平滑肌细胞；mRNA

1材料与方法

本课题前期的糖尿病大鼠模型建立、糖尿病大鼠主动脉血管病变检测、糖尿病大鼠VSMCs体外培养及鉴定以及不同梯度浓度γ-分泌酶抑制剂（DhPT）干预Notch信号通路后对DM大鼠VSMCs活性及毒性、凋亡、细胞周期的影响均已完成，且DM大鼠VSMCs已完成冻存。仅从不同梯度浓度γ-分泌酶抑制剂（DAPT）干预Notch信号通路后对DM大鼠VSMCs基因影响进行论述。

1.1实验对象

取已完成的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞，进行细胞复苏与传代。

1.1.1VSMCsmRNA的抽提

取冻存已裂解的细胞，在常温下放置到完全溶解。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃，作为实时定量PCR扩增实的模版。

1.1.2 RNA质量检测，紫外吸收法测定

取少量RNA溶液用TE稀释（1：100）后，读取260nm和280nm两处的吸收值，测定RNA溶液的浓度和纯度。进行浓度测定，在进行纯度检测，mRNA纯度为mRNA溶液的A260/A280的比值，比值范围1.9到2.1.

2反应条件

如表1。

3引物设计软件

Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补。

根据文献设计出相应的引物。

目标基因：

上游引物为5'：TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGCTAT 3'

下游引物为5'：GAC GAC CCCGAACCG CGACCG TAACAG 3'

扩增条目的条带大小为155bp。

对照基因：

上游引物5'：TTATTA GAG GGTGGGGTGGATTGTTAT3'

下游引物5'：CAAGAC CCC GAACCG CGACCGATACCA3'

扩增条目的条带大小为156bp。

4结果

通过实时定量PCR方法分析得出，加γ-分泌酶抑制剂（DAPT）的培养基的DM大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）溶解温度峰值Tm进行检测看见：溶解温度在86.0℃——84.0℃之间，溶解温度单一，溶解曲线呈单峰，标明为特异性扩增。而对照组（正常培养基）未见特异性峰值。从PCR溶解曲线我们看见DAPT干预Notch信号通路后对体外培养的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趋势，使其溶解温度峰值前移，溶解曲线呈单峰，复制率下降，将会导致细胞凋亡。

5结论

本课题通过实时定量PCR技术分析探讨Notch信号通路在糖尿病大鼠血管再生及成熟中的作用机制，分析探讨Notch信号通路对体外培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的mRNA水平有何影响，为进一步研究糖尿病患者血管再生提供依据，有可能成为获得更多有功能的血管以促进血管新生，为临床治疗糖尿病足溃疡、缺血性疾病、改善预后提供新思路和新途径，并为以后系统科学地研究血管再生提供方向，为缺血性疾病的治疗提供靶向药物，希望在不久之后会应用到临床治疗中，造福广大糖尿病足溃疡、缺血性疾病患者，实现从实验室到临床的完整对接，进一步提升糖尿病足溃疡、缺血性疾病治疗的基础研究水平。

（通讯作者：金松）