吖啶橙荧光染色法在循环肿瘤细胞筛查中的应用

刘敏，马富玲，韩荣，李美，刘淑芬，张淑敏

诊断技术

吖啶橙荧光染色法在循环肿瘤细胞筛查中的应用

刘敏，马富玲△，韩荣，李美，刘淑芬，张淑敏

目的应用吖啶橙荧光（AO-F）染色法搭建循环肿瘤细胞（CTCs）筛选平台，并将其应用于肾癌患者外周血CTCs筛查。方法选择转移性肾细胞癌患者27例（研究组），用不同浓度的血清培养肾癌原代肿瘤细胞和细胞系769-P，分别制备涂片于荧光显微镜下，观察细胞形态及着色情况是否一致；随机计数5个视野下AO-F阳性（+）细胞占769-P细胞的比例，评估AO-F染料对肿瘤细胞的敏感性；清晨抽取10例健康体检者（对照组）空腹外周血，红细胞裂解后富集单个核细胞，配制含1×106个细胞的悬液；取对数生长期肾肿瘤细胞，配制成每管分别含500、200、100、50、10个肿瘤细胞的悬液，与1×106个单个核细胞混合，建立肾癌外周血CTCs模型，AO-F染色后计算肿瘤细胞回收率；另计算2组外周血AO-F+细胞的检出率，分析其与患者临床参数之间的关系。结果肾癌原代肿瘤细胞和细胞系769-P均呈现出鲜明色彩，两者具有相似的形态学特征，平均每个视野下AO-F+细胞占肿瘤细胞的比例为93%±3%。含500、200、100、50个细胞的悬液组肿瘤细胞回收率（%）分别为10.2±3.8、9.2±2.3、10.8±2.6、10.5±1.9，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。含10个细胞的悬液组偶然可检测到AO-F+细胞。对照组无一例阳性，研究组9例检测到AO-F+细胞，检出率为33.33%；检出率在不同年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、Furhman分级、转移部位及带瘤状态间差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论AO-F染色法筛查肾癌患者外周血CTCs切实可行，并具有高度的特异性和可重复性，对早期预测肾癌复发转移有一定参考价值。

吖啶橙；显微镜检查，荧光；癌，肾细胞；循环肿瘤细胞

近年来，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）作为肿瘤的“液体活检标本”，在肿瘤早期诊断、疗效判定、预后判断方面的价值备受关注。CTCs的出现可作为评估肿瘤患者预后的因素之一，并与肿瘤有无复发转移有关［1］。近年来有许多前沿技术应用于CTCs检测，目前只有Cell Search系统得到欧美国家认同。Cell Search系统通过细胞表面标志富集CTCs，但因肾癌细胞缺乏特异性标志物限制了其在肾癌领域的应用。吖啶橙（acridine orange fluorescent，AO-F）作为一种荧光络黄染料，具有高度异染性，已经应用于胸水、腹水、尿液等标本的肿瘤细胞检测［2］。本研究旨在建立吖啶橙荧光法筛查CTCs的技术，并将其应用于肾癌患者的早期诊断及术后随访。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2013年7月—2014年5月我院收治的转移性肾细胞癌患者27例（研究组），其中男19例，女8例；年龄28～79岁，平均（61.63±12.04）岁。患者均有明确病理组织学诊断证实为肾细胞癌，且具有充分临床或影像学证据确诊为转移性肾细胞癌，均未接受任何治疗。另择10例健康体检者作对照组，其中男6例，女4例；年龄26～79岁，平均（50.1±16.88）岁。本研究经我院医学伦理委员会批准，且获研究对象知情同意。

1.2主要试剂和仪器769-P细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，RPMI-1640培养基、热灭活胎牛血清、淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物科技有限公司，胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司，荧光显微镜（Olympus BX51），离心机（BAIYANG B160A），超净台（Labeier），CO2培养箱（Forma Scientific）。

1.3方法

1.3.1肿瘤细胞培养新鲜肾癌组织经胶原酶Ⅱ消化，加淋巴细胞分离液，离心获得原代肾癌细胞。加含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO2条件下传代培养。同时将769-P细胞系加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。待细胞覆盖瓶底80%时，胰蛋白酶消化后按1∶3传代。每5 d传代1次。取对数生长期769-P细胞备用。

1.3.2AO-F染色评估AO-F染料对肿瘤细胞的敏感性分别制备原代和769-P细胞涂片，涂片经AO-F染色：AO-F染液中浸泡3 min，PBS冲洗；HCl溶液冲洗5 s，PBS冲洗；CaCl2溶液浸泡3 min，PBS冲洗。加盖片于荧光显微镜下观察细胞形态及着色情况。随机读取5个视野计算AO-F阳性（+）细胞占769-P细胞的比例，评估AO-F染料对肿瘤细胞的敏感性。

1.3.3富集对照组外周血单个核细胞对照组清晨空腹抽取肘正中静脉血5 mL，低张红细胞裂解液破红，乙二胺四乙酸（EDTA）漂洗后固定2次，2 000 r/min离心10 min，获得单个核细胞。制备细胞涂片，经AO-F染色后荧光显微镜下观察细胞形态及着色情况。同时PBS逐级稀释，配制含1×106个细胞的悬液置于玻璃管中，共20管，备用。

1.3.4模拟肾癌患者外周血样取对数生长期的769-P，计数后PBS逐级稀释，配制成每管分别含500、200、100、50、10个769-P细胞的悬液，与1×106个单个核细胞混合，模拟肾癌患者外周血样，离心、固定、涂片、染色，重复4次，计算肿瘤细胞回收率。

1.3.5检测研究组外周血中AO-F+细胞研究组患者于清晨空腹抽取肘正中静脉血6 mL。为避免污染摒弃前1 mL。按1.3.3中方法于2 h内处理。计算AO-F+细胞的检出率，并分析检出率与患者临床病理参数之间的关系。

1.4实验结果判读（1）AO-F+细胞：细胞明显增大，核异型性明显，核浆比例失调；胞核、胞浆均着色，胞核呈亮黄绿色，边缘不齐；胞浆呈桔红色，含量少，即为CTCs。（2）AO-F阴性（-）细胞：细胞体积小，可见多核、杆状核、分叶核等白细胞亚群；胞核呈亮绿色荧光，胞浆不着色。

1.5统计学方法应用SPSS 17.0软件进行处理。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料组间比较采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肿瘤细胞生长特点细胞生长迅速且良好，3次传代后，质量和数量均能满足后续实验要求。见图1。

Fig.1The primary renal cancer cells observed under inverted microscope（×200）图1 原代肾癌细胞光镜观察（×200）

2.2各组AO-F染色情况比较AO-F染色后，原代细胞和细胞系均呈现出鲜明色彩，两者具有相似的形态学特征：细胞大小不一，形态各异，核浆比例失调，胞核呈明亮黄绿色，胞浆呈鲜亮桔红色，见图2a。对照组外周血白细胞大小均一，胞核被染为亮绿色，胞浆不着色，可见各亚群细胞核形态，见图2b；研究组涂片上可见到两类细胞，大部分为白细胞，仅有个别AO-F+的肿瘤细胞，数目少，但醒目（箭头所示），见图2c。

Fig.2Comparison of AO-F staining between three groups（×200）图2 各组细胞AO-F染色情况比较（×200）

2.3AO-F染料对肿瘤细胞的敏感性及肿瘤细胞回收率平均每个视野下AO-F+细胞占769-P细胞的比例为93%±3%。含500、200、100、50个细胞的悬液组肿瘤细胞回收率（%）分别为：10.2±3.8、9.2± 2.3、10.8±2.6、10.5±1.9，组间差异无统计学意义（F= 1.001，P＞0.05）。含10个细胞的悬液组偶然可检测到AO-F+细胞。

2.4研究组CTCs检出率及与临床病理资料的关系9例检测到AO-F+细胞，检出率为33.33%。检出率在不同年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、Furhman分级、转移部位及带瘤状态间差异均无统计学意义，见表1。

Tab.1Clinical parameters and AO-F positive rate in 27 patients with metastasized renal cancer表1 27例转移性肾细胞癌患者CTCs检测结果及与临床病理资料的关系例（%）

3 讨论

肿瘤微转移是单个细胞或微小细胞团形式存在的隐匿性转移，存在于血液循环中，但常规临床病理学和影像学方法均不能检出，需要借助特殊手段才能检出。早在1869年，澳大利亚学者Ashworth首次提出了CTCs的概念。细胞自原发灶脱落进入血液循环在远处组织、器官增殖并形成转移灶，这部分进入循环系统的细胞即被称之为CTCs。肿瘤细胞进入外周血中是发生微转移以及远处转移的前提［3］。因此，检测CTCs对监测肿瘤复发、转移有重要意义。

目前许多前沿技术已经应用到CTCs检测，如RT-PCR、microRNA、生物芯片等［4-5］，但各自因其不能克服的缺点未被认可。Cell Search系统是目前国际上唯一认可的技术，已被批准用于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌中CTCs的检测。肾癌是泌尿系统常见肿瘤之一，起源于肾小管上皮细胞，术后患者死亡的主要原因是发生转移。肾癌作为上皮组织来源的肿瘤，理论上细胞角蛋白（cytokeratin，CK）表达率应该较高，但Gradilone等［6］选用CK8/18/19抗体标志肿瘤细胞对25例转移性肾癌患者血中CTCs使用Cell Search系统进行检测，检出率仅有16%，同时对检出的CTCs行RT-PCR扩增，发现CK8/18/19表达率极低，表明肾肿瘤细胞表面抗原进入血液循环成为CTCs后发生了变化，导致其表面缺乏特异性肿瘤标志物。由于肿瘤的异质性，Cell Search系统通过细胞表面标志物筛查CTCs，不可避免地使不表达特异性标志物的肿瘤细胞亚群“逃脱法网”，造成一定的假阴性。另外由于检测成本和技术要求较高，难于在基层医院普及，这些都使得Cell Search系统的临床价值得不到体现。因此，发展一种新的检测方法很有必要。

AO-F作为一种荧光络黄染料，具有高度异染性，被广泛应用于医学和生物学的研究中。AO-F染色法的原理是肿瘤细胞能够特异性地与DNA和RNA结合，从而使肿瘤细胞变成“彩色”，在显微镜下明显区别于正常外周血单个核细胞。此法综合细胞形态学和细胞化学两方面的特点来判断细胞良、恶性，为不表达特异性标志物的CTCs检测提供了新思路。

本研究结果显示，AO-F染色后平均每个视野下AO-F+细胞占769-P细胞的比例为93%±3%，证实AO-F染料对肿瘤细胞敏感性高。一定数量的肿瘤细胞与健康外周血单个核细胞混合，建立肾癌外周血CTCs模型，用AO-F法进行检测，结果显示各组肿瘤细胞回收率差异无统计学意义，提示应用AO-F法检测CTCs较稳定，具有较好可重复性。含10个细胞的悬液组偶然可检测到AO-F+细胞，与李燕等［7］建立的膜滤过联合激光扫描细胞计量仪（ISET+LSC）检测CTCs相比，回收率基本相仿，但较新近出现的CTCs芯片技术相比，尚不够理想。整个过程中的离心、漂洗、计数、染色以及AO耐光性弱的内在特性［8］等都可造成不同程度的细胞丢失，需继续优化。对照组未检测到AO-F+细胞，提示该方法有较高的特异性。

本研究结果显示，研究组有9例采用AO-F染色法检测到CTCs，检出率为33.33%。检出率在不同年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、Furhman分级、转移部位及带瘤状态间差异均无统计学意义。李蕾等［9］研究显示乳腺癌患者血中CTCs检出率与转移部位存在一定关系。本研究未发现两者存在相关关系，可能与肿瘤类型、样本例数大小有关，尚需大样本研究验证。Bluemke等［10］检测154例肾癌患者的233份血样中的CTCs发现，CTCs检出率与患者年龄、性别、肿瘤大小无关，与本研究结果基本一致，另外该研究发现CTCs是肾癌的独立预后因素之一，与淋巴结阳性及转移密切相关。对于已经发生转移但外周血中未检出CTCs的患者，这种不一致性可能是由于肿瘤细胞释放进入血液的周期性变化以及疾病进展过程中肿瘤组织与宿主免疫状态的相互抗衡等导致的［11］。

AO-F法筛查CTCs作为一种新的检测方法有其独特优势，可以提供CTCs形态学和细胞化学方面的详细信息，且克服肿瘤细胞异质性等问题，为不表达特异性上皮标志物的CTCs检测提供了新思路。

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（2014-10-13收稿 2015-03-02修回）

（本文编辑 陈丽洁）

The application of acridine orange fluorescent staining method in circulating tumor cell

LIU Min，MA Fuling△，HAN Rong，LI Mei，LIU Shufen，ZHANG Shumin
Department of Urology，The Second Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin Institute of Urinary Surgery，Tianjin 300211，China△

ObjectiveTo establish the screening platform of circulating tumor cells（CTCs）using acridine orange fluo⁃rescent（AO-F）dyeing method，and to apply it in the screening of peripheral blood CTCs in patients with kidney cancer. MethodsTwenty-seven patients with metastatic renal cell carcinoma was included in this study.Primitive tumor cells and kidney cancer cell line 769-P were cultured with different concentrations of fetal bovine serum.Smears were prepared and observed under fluorescence microscopy.The percentage of AO-F positive staining of 769-P cells under 5 random sights was calculated.The sensitivity of AO-F staining to cells was evaluated.The 5 mL morning fasting venous blood was obtained from 10 subjects with healthy check-up.The 1×106cell suspension was prepared.The logarithmic phase of renal tumor cells was used to prepare tube containing 500，200，100，50 and 10 tumor cell suspension，which were mixed with 1×106nucleated cells to establish CTCs model of renal cancer.AO-F staining method was used to detect the expression of AO-F positive cells.The correlation between expression of AO-F positive cells and clinical parameters was analyzed.ResultsThe prima⁃ry cells and cell line 769-P showed similar bright color and morphological characteristics.The percentage of AO-F positive staining in 769-P cells was 93%±3%under 5 random sights.The recovery rates（%）of four groups（500，200，100 and 50 tu⁃mor cell suspension）were 10.2±3.8，9.2±2.3，10.8±2.6 and 10.5±1.9，respectively.There were no significant differences in recovery rates between four groups（P＞0.05）.The group of 10 tumor cell suspension could find AO-F positive staining cells occasionally.Zero case was positive in controls.Nine of 27 patients were positive and the rate was 33.33%.There were no significant statistical differences in AO-F positive rates between gender，age，tumor size，pathological pattern，Furhman stage，metastasis of lung and presence of tumor（P＞0.05）.ConclusionIt is confirmed that the method of CTCs staining with AO-F，which has high specificity and reproducibility，is feasible to detect CTCs and worthy of being studied.There is a certain reference value to predict tumor recurrence and metastasis.

acridine orange；microscopy，fluorescence；carcinoma，renal cell；circulating tumor cells

R737.11；R446-39

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.025

天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所（邮编300211）

刘敏（1989），女，硕士在读，主要从事肾癌循环肿瘤细胞临床价值研究

△通讯作者E-mail：18722569796@163.com