双重荧光实时PCR法鉴定SRBⅠ基因敲除小鼠

潘丽莉，郑璐，张俊，于洋，姚霜，喻妙梅，冯悦华，罗光华

双重荧光实时PCR法鉴定SRBⅠ基因敲除小鼠

潘丽莉，郑璐，张俊，于洋，姚霜，喻妙梅，冯悦华，罗光华△

目的建立一种双重荧光实时PCR鉴定B族Ⅰ型清道夫受体（SRBⅠ）基因敲除小鼠的方法。方法提取小鼠尾尖DNA，应用自行设计的鉴定野生型和敲除型SRBⅠ基因的引物和探针，经PCR扩增后，在FAM通道及CY5通道判断小鼠基因型。同时应用基因测序技术对结果进行验证，并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果仅在FAM通道出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因野生型小鼠，仅在CY5通道出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因敲除型小鼠，在两个通道都出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因杂合型小鼠。结果与DNA测序法吻合，检测野生型和突变型的灵敏度均达4×101拷贝/μL。结论新方法简单、快速、准确，适用于分型SRBⅠ基因敲除小鼠。

抗原，CD36；清道夫受体BⅠ；双重荧光实时PCR；基因敲除

B族Ⅰ型清道夫受体（scavenger receptors class B type I，SRBⅠ）最早是在以乙酰化低密度脂蛋白（AcLDL）为配体克隆的清道夫受体家族（scavenger receptors，SR）中发现的［1］，是第一个在分子水平上得到证实的高密度脂蛋白（HDL）受体，属于B亚族Ⅰ型。最近研究发现，它不仅参与胆固醇的逆转运，有益于心血管系统，而且参与糖代谢、骨代谢、雌激素等的调节［2］，在这些疾病研究中常用SRBⅠ基因敲除小鼠作为动物模型［3］，而该基因敲除动物在用于研究前必须进行基因型鉴定，传统PCR-琼脂糖凝胶电泳技术耗时长且易污染，单重荧光定量PCR需要多管反应体系，较为麻烦，因此建立一种简单、快捷、准确的新方法尤为必要。本研究通过应用双重荧光PCR技术建立一种新的同时鉴定SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的方法，效果很好，报告如下。

1 材料与方法

1.1材料SRBⅠ基因敲除小鼠由南京医科大学馈赠，品系为C57BL/6。Ezup柱式动物基因组抽提试剂盒购自上海生工公司，Taq热启动酶、dNTP混合液、10×PCR缓冲液等购自TaKaRa公司，Light Cycler荧光定量PCR仪购自Roche公司。

1.2DNA提取用温水孵育小鼠尾巴2～3 min，采集尾尖5 mm，按Ezup柱式动物基因组抽提试剂盒说明书操作提取基因组DNA，置于4℃保存。

1.3引物及探针的设计和合成根据NCBI数据库中小鼠SRBⅠ基因序列及文献［4］报道的SRBⅠ基因敲除和插入序列，用Primer Premier5.0软件设计正、反义引物和探针，引物和探针均由上海生工公司合成和修饰，见表1。

Tab.1Primers and probes for wild and knockout SRBⅠgene mice表1 检测SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的引物和探针

1.4实时荧光PCR总反应体系为25 μL，包括DNA模板2 μL，25 mmol/L的MgCl21 μL，5 U/μL Taq热启动酶0.25 μL，100 μmol/L野生型及敲除型正、反义引物和探针均为0.1 μL，2.5 mmol/L dNTP混合物2 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，ddH2O补足至25 μL。循环参数:95℃预变性3 min； 98℃10 s，58℃10 s（温度转换率为4.4℃/s），共40个循环；40℃持续收集荧光数据。反应在Light Cycler 480Ⅱ型荧光定量PCR扩增仪上进行。

1.5质粒载体构建根据不同的基因型分别构建野生型和敲除型的载体。扩增产物片段送上海生工公司克隆并测序。

2 结果

2.1结果判断野生型小鼠在FAM通道出现明显“S”型扩增曲线，在CY5通道无扩增；敲除型小鼠在CY5通道出现明显“S”型扩增曲线，在FAM通道无扩增；在2个通道都出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因杂合型小鼠，见图1。

Fig.1The analysis of amplification curves图1 扩增曲线分析图

2.2灵敏度分析分别选取野生型和敲除型载体作为模板，经10倍连续稀释（4×101～4×105），按上述条件进行荧光定量RT-PCR。结果表明，该法对检测SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的灵敏度均为4×101拷贝/μL，见图2。

Fig.2The analysis of sensitivity图2 灵敏度检测结果

2.3准确性分析选取野生型和敲除型样本各1份进行测序，并用BLAST比对，RT-PCR结果均与测序结果一致。野生型和敲除型的部分测序序列见图3。

Fig.3The PCR product sequence of the wild and SRBⅠknockout mice图3 SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠PCR产物测序图

3 讨论

随着基因敲除技术和转基因技术的广泛应用，已经证实SRBⅠ不但在脂蛋白代谢和胆固醇转运中发挥着重要作用，而且在一氧化氮代谢、丙肝病毒感染、正常红细胞成熟和雌性生育等方面也显示出较强的调节作用［5-6］。本研究旨在建立一种快速准确的检测野生型和SRBⅠ基因敲除型小鼠的方法，引物设计是整个方法建立的关键，利用Primer Premier5.0软件设计出针对野生型和SRBⅠ基因敲除型高度特异的引物和探针，在以同一浓度阳性核酸作为模板的反应体系中，优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值选择最佳引物和探针浓度，建立最优化的反应体系。本研究所用的2条探针，分别标记的是FAM和CY5荧光基团，在用LightCycler480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪进行检测时，可分别选择FAM或CY5通道作为观察结果的参数，即有较典型的“S”型扩增曲线。该法灵敏度试验表明检出限可达到4×101拷贝/μL，特异性也较高，无任何交叉反应，与测序结果一致。

在进行基因型鉴定时，单重荧光定量PCR需要多管反应体系，较为麻烦。而PCR-凝胶电泳法耗时长，易发生污染，且灵敏度和特异性较低，均较少使用［7-8］。本研究实现了单管同时检测并区分野生型和SRBⅠ基因敲除型小鼠，比普通PCR和单重荧光PCR更简便、快速，证明双重荧光PCR引物扩增互不干扰且有很高的扩增效率。综上所述，本研究成功建立了双重荧光定量PCR检测SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的方法，可以推广使用。

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（2015-02-02收稿 2015-02-26修回）

（本文编辑 闫娟）

Development of a duplex fluorescence RT-PCR assay for identifying SRBⅠgene knockout mice

PAN Lili，ZHENG Lu，ZHANG Jun，YU Yang，YAO Shuang，YU Miaomei，FENG Yuehua，LUO Guanghua△
Comprehensive Laboratory，The Third Affiliated Hospital of Soochow University，Changzhou Key Lab of Individualized Diagnosis and Treatment Associated with High Technology Research，Changzhou 213003，China△

ObjectiveTo develop a duplex fluorescence RT-PCR assay for detection of scavenger receptor class B，typeⅠ（SRBⅠ）knockout mice.MethodsPrimers and probes were designed according to knockout region of SRBⅠgene and related substituted sequence.DNA samples were extracted from tails of mice and performed amplification using realtime PCR.SRBⅠgenotypes of mice were analyzed according to amplification curves of FAM and CY5 channels.Finally，the sensitivity of the method was detected and the accuracy was verified by the direct sequencing.ResultsThe homozygous SRBⅠwild genotype showed an amplification curve only in FAM channel.When the homozygous SRBⅠknockout genotype was present，the typical S amplification curve appeared only in the CY5 channel.Heterozygous genotype showed two typical S amplification curves in both FAM and CY5 channels，respectively.The results showed that the sensitivity reached 4×101copies/μL，and there was complete concordance between this method and direct DNA sequencing.ConclusionThe new method is simple，rapid and accurate，which is suitable for genotyping SRBⅠknockout mice.

antigens，CD36；scavenger receptors-BⅠ；dual fluorescence real-time PCR；gene knockout

R349.82

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.008

国家自然科学基金资助项目（81201352）；江苏省自然科学基金资助项目（BK2012154）

苏州大学附属第三医院综合实验室，常州市个性化诊疗高技术研究重点实验室（邮编213003）

潘丽莉（1986），女，医学学士，主要从事疾病分子生物学诊断的研究

△通讯作者E-mail:shineroar@163.com