金黄色葡萄球菌标准物质的定值方法

郑洁，柯璐，2，张温玲，2，戴晓丽，2，杨玮玮，郑晶，2

（1.福建出入境检验检疫局技术中心，福建福州350003；2.福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建福州350003；3.福建农林大学动物科学学院，福建福州350001）

金黄色葡萄球菌标准物质的定值方法

郑洁1，柯璐1，2，张温玲1，2，戴晓丽1，2，杨玮玮3，郑晶1，2

（1.福建出入境检验检疫局技术中心，福建福州350003；2.福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建福州350003；3.福建农林大学动物科学学院，福建福州350001）

对含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质进行定值，包括金黄色葡萄球菌计数方式的选择，标准值的测定，以及不确定度的分析。总不确定度以扩展不确定度表示。结果显示，金黄色葡萄球菌3种计数方式，BP平板倾注法计数结果与PCA计数法测定一致，BP平板倾注法SD值＜BP平板涂布法SD值，表明采用BP平板倾注法计数金黄色葡萄球菌的结果精密度、再现性较好，有利于试验结果的复现。标准值测定结果为275 CFU/瓶；总不确定度为6。因此，标准物质定值结果为（275±6）CFU/瓶。

金黄色葡萄球菌；标准物质；定值；不确定度

标准物质的定值是对标准物质特性量赋值的全过程。标准物质作为计量工具的一种，必须保证其复现、保存和传递量值的特性，因此必须保证标准物质的量值具有溯源性，继而就必须对标准物质研制单位进行计量认证，对所用的分析测量方法进行研究，对测量结果的不确定度进行分析。金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）是引起食物中毒的常见致病菌，在公共卫生学上具有重要意义。作者对含鸡肉基质的金葡菌菌体标准物质的定值方法进行了对比研究，建立了该标准物质的定值方式，给今后同类型标准物质的定值验证提供参考。

1　材料与方法

1.1试验样本

试验样本（含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质），批次编号为JP0212，由作者所在实验室提供。样品检测前进行了均匀性和稳定性试验，在随后统计分析与评价中可以忽略样品不稳定性和不均匀性的影响。

1.2仪器与设备

KD-2100TBC电子天平，福建科迪技术有限公司制造；SHKE4450型台式恒温振荡器，美国Thermo公司制造；可调移液器（100～1 000 μL），芬兰雷勃（中国）公司制造；BC/BD-718A冷藏冷冻箱，青岛海尔特种电冰柜有限公司制造；PHW-165Q恒温培养箱，中科生命科技有限公司研制；MU-425-400E生物安全柜，美国NUAIRE公司制造；MS3 DIGITAL涡旋振荡器，德国IKA公司制造；Stomacher3500型拍击式均质器，英国WARD公司制造；HV-85型自动高压灭菌器，日本HIRYAMA公司制造。

1.3主要培养基的配制

营养肉汤、平板计数琼脂（PCA）、脑心浸出液肉汤（BHI肉汤）、Baird-Parker培养基（BP培养基），均购自北京陆桥。

2　试验方法

2.1金黄色葡萄球菌菌落计数方法的选择试验

2.1.1试验菌液制备将新鲜培养的菌悬液（含菌量约为3.6×107CFU/mL）涡旋均匀，吸取1 mL加入9 mL无菌生理盐水，制成体积比1∶10的稀释液，再依次进行10倍递增稀释，使菌液稀释液的最终含菌量在100 CFU/mL左右。

2.1.2试验方法分别采用PCA计数法、Baird-Parker倾注法、Baird-Parker平板涂布法3种计数方法，对2.1.1项所述制备的试验菌液进行计数。

1）PCA计数法：吸取1 mL制备的菌液稀释液置于无菌培养皿中，然后倒入15 mL冷却至50℃的琼脂计数培养基，摇匀。待平板冷却凝固后，在（36±1）℃下倒置培养18～24 h；

2）BP倾注法：吸取1 mL制备的菌液稀释液，倾注入15 mL冷却至42℃的BP培养基，摇匀。待平板冷却凝固后，在（36±1）℃下倒置培养18～24 h；

3）BP平板涂布法：取3片制好的BP琼脂平板，将制备的菌液稀释液以0.2、0.3、0.4 mL的量分别加入到3个平板中（根据GB4789.10-2010规定），用无菌三角推棒将菌液涂布整个平板，静置10 min，待菌液吸收完全后，在（36±1）℃下倒置培养18～24 h。

以上3组试验各进行10次平行测定，同时用无菌生理盐水做空白对照，培养后观察结果。

2.1.3结果判定计数在BP平板上菌落直径为2～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，其外层有一透明圈，用接种针接触菌落有似奶油至树胶样硬度的菌落。记录具有该典型特征的金黄色葡萄球菌的菌落数。

2.2样本标准值的检测

本标准物质冷冻干燥后的脱水率为17.57%，冻干后的质量约为2 g，根据标准物质冻干前后的质量差，吸取7 mL无菌水对冻干物质进行溶解复原。检测步骤如下：

1）用酒精棉球擦拭冻干瓶丁基胶塞，待冻干物恢复至室温后检测；

2）用镊子取下丁基胶塞，倒置放于桌面；

3）加入7 mL无菌水对冻干物进行溶解，静置2 min；

4）加入9 mL无菌水，盖上丁基胶塞，于涡旋仪上高速混匀1 min，制成体积比1∶2的菌悬液原液；

5）用镊子取下丁基胶塞，倒置放于桌面，用平头移液管吸取1 mL菌悬液原液注于盛有9 mL无菌生理盐水的试管中，旋好试管盖后于涡旋仪上高速混匀10 s，制成10-1的菌悬液，依次制备10-2的菌悬液；

6）分别吸取上述10-1、10-2的菌悬液进行计数。

标准值检测方式根据2.1项试验结果决定。

2.3标准物质不确定度评定

2.3.1金黄色葡萄球菌菌落总数测定的不确定度评估随机抽取15份样品，每份样品作2个平行测试，按照2.1试验选择的计数方法，对这些样品进行菌落计数，再利用贝塞尔计算公式计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差，从而计算出不确定度。

2.3.2标准物质的定值方法不确定度评估根据对标准物质均匀性不确定度的评估结果，对标准物质定值方法进行不确定度评估。所用的评估方法与金黄色葡萄球菌菌落总数测定的不确定度评估相同。

2.3.3电子天平的不确定度评估电子天平不确定度评估的参考测量依据：JJG99-2006《砝码检定规程》；JJG1036-2008《电子天平检定规程》；JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》。电子天平计量误差包括重复性误差、线性误差和四角误差3项。

试验过程采用德国制Satorius BS200S-WEI电子天平，最大量程为310 g，测量分度d=1 mg，检定分度e=10 mg，线性误差△i=2 mg，四角误差△c=1 mg。本次试验所用砝码为加载最大标准砝码值100 g的F1等级。

3　结果与分析

3.1不同金葡菌计数方式的比较

采用PCA计数法（A组）、Baird-Parker倾注法（B组）、Baird-Parker平板涂布法（C组）3种计数方法，对含菌量相同的金葡菌样液进行计数，结果如表1所示。

表1　金葡菌3种计数方式的对比结果Table 1　Comparison results of the S.aureus count methods

对试验所得结果进行方差分析，分析结果见表2。

表2　方差分析结果Table 2　Results of analysis of variance

从表2可以看出，对3种不同计数方法所得数据进行方差分析，结果如下：BP倾注法用于计数金黄色葡萄球菌，其计数结果与细菌总数测定一致，且从SD值来看，BP平板倾注法小于BP平板涂布法，表明采用BP平板倾注法计数金黄色葡萄球菌的结果精密度、再现性较好，有利于试验结果的复现。据此，BP倾注法相比于BP平板涂布法具有操作简便、结果稳定、再现性好的特点。本试验中所涉及金黄色葡萄球菌计数均采用BP倾注法。

3.2样本标准值的检测结果

抽检的样品于同一时间同一试验条件下进行检测。试验结果及统计结果如表3所示。

表3　标准物质中金葡菌的含量Table 3　S.aureus content in Reference Material

由表3结果计算得试验用标准物质样本的标准值为（279+275+273+273+276）/5=275 CFU/瓶。

3.3样本不确定度的评估结果

3.3.1金黄色葡萄球菌计数方法的不确定度评定结果取不同批次的10份样品进行检测，每份样品平行测定2次，共进行20次菌种计数的检测，检测结果见表4。

表4　计数方法不确定度的检测结果Table 4　Uncertainty result of count methods

根据公式

计算每个样品检测结果的残差值υi，并进一步计算样品检测结果的残差平方υi2及残差平方和Συi2，计算结果见表5。

表5　检测结果的残差平方Table 5　Test results of residual square

根据贝塞尔计算公式

可计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差Sp=0.053。式（2）中，m为检测的样本数，即m= 10；n为每个样品重复检测的次数，即n=2。

按公式

取置信水平95%，v（自由度）=10，经过查t分布表得：t0.05（10）=2.228；得出U=2.228×0.038=0.084。

当检测结果以2次测量对数值的平均值表示时，其值区间分布于±0.084之间。这个取值区间适合于任何一次测量。由于菌落计数结果以整数表示，因此该不确定度可忽略不计。

3.3.2金黄色葡萄球菌标准物质定值方法的不确定度评定结果取不同批次的冻干标准物质10份，每份样品平行测量3次，计数结果见表6。

表6　定值方法的计数结果Table 6　Result of fixed-value method of counting

当测量检验结果用3次测量值平均值表示结果时，其值分布区间在±6之间。这个取值的区间适用于每一次测量。

3.3.3电子天平的不确定度评估电子天平不确定度的评估结果见表7。

表7　电子天平不确定度的评估结果Table 7　Results of Evaluation of the Uncertainty which is from Electronic Balance

1）四角误差的标准不确定度Uc评估：四角误差的标准测量结果不确定度应该按照正态分布情况考虑。在置信水平为95%时，包含误差因子k=3；因此四角误差的标准测量结果不确定度为

评估结果为Uc=1/3=0.33 mg

2）线性误差的标准不确定度UL评估：UL的计算公式为

式（7）中，电子天平线性误差Ui属于B类的不确定度，该测量值服从均匀性分布，为

而UA为使用最大量程加载砝码（100 g）标准时的不确定度，

在置信水平为95%，自由度Vf足够时，式中δ为砝码量测允许误差值0.5，包含误差k=3，则

3）重复性误差测量结果的标准不确定度Ur评估：重复性误差

计算得△r=155.005-155.004=0.001 g

当n=9，其测量值接近正态分布的前提下，每次测量结果的试验标准差

表8　极差系数C及自由度Table 8　　Terrible coefficient C and degrees of freedom

4）合成标准不确定度U：合成标准不确定度

计算得U=1.425 2mg。

自由度

式（13）中，Uc的Vf足够大记为∞；UL的Vf足够大记为∞；根据表8极差系数C及自由度，当n=9时，Vf=6.8，则Veff=346。

5）扩展不确定度U：扩展不确定度

置信水平为95%时由JJG 1059-1999附录A得包含因子k=1.96，而u=1.425 18。因此，本试验用的电子天平的扩展不确定度为U=1.96×1.425 18= 2.793 4 mg，在本标准制备中可忽略不计。

由以上结果可知，本试验标准物质样本的定值结果为（275±6）CFU/瓶。

4　结语

标准物质的定值表示为：标准值±不确定度。本试验中对样品的标准值的计数选用了BP平板倾注法，其结果精密度、再现性较好，有利于试验结果的复现。此外，计数时，由于金葡菌在BP平板上的菌落特征明显，因此在很大程度上降低了操作人员的计数误差。对整个定值过程进行了不确定度的分析，包括了金葡菌计数的不确定度（0.084）、标准值计算的不确定度（6），以及电子天平的不确定度（2.793 4）。由于菌落数为整数，最小值为0，而标准物质的质量单位为g，因此金葡菌计数的不确定度以及电子天平的不确定度在本标准物质定值中可忽略不计。

本试验中使用的标准物质的定值方法及不确定度的评估方案适用于标准物质的定值和不确定度的测定，可作为判断制备成果适用性的理论依据，给同类制作工艺提供了参考。

［1］卢晓华，李红梅，郭敬.标准物质领域总体发展趋势［J］.中国计量，2010（7）：75-76.

LU Xiaohua，LI Hongmei，GUO Jing.Standard material area overall development trend［J］.China Metrology，2010（7）：75-76.（in Chinese）

［2］卫生部，国家标准化管理委员会.GB 4789.10-2010食品微生物学检验：金黄色葡萄球菌检验［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［3］卫生部，国家标准化管理委员会.GB 4789.2-2010食品微生物学检验：菌落总数测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［4］杨力.电子天平测量不确定度评定［J］.煤质技术，2008（1）：41-42.

YANG Li.Electronic balance measurement uncertainty evaluation［J］.Coal Quality Technology，2008（1）：41-42.（in Chinese）

［5］韩永志.标准物质的定值［J］.化学分析计量，2001，10（5）：38-39.

HAN Yongzhi.Constant value of standard material［J］.Chemical Analysis of Measurement，2001，10（5）：38-39.（in Chinese）

［6］俞晓平，叶子弘，蒋家新，等.生物计量及其在检验检疫中的应用研究［J］.中国计量学院学报，2008，19（4）：289-295.

YU Xiaopin，YE Zihong，JIANG Jiaxin，et al.The research of biometric and its application in inspection and quarantine［J］. Journal of China Institute of Metrology，2008，19（4）：289-295.（in Chinese）

Discussion About the Fixed Value Method of Staphylococcus aureus Reference Materials

ZHENG Jie1，KE Lu1，2，ZHANG Wenlin1，2，DAI Xiaoli1，2，YANG Weiwei3，ZHENG Jin1，2
（1.Technology Center，Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Fuzhou 350003，China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，Fuzhou 350003，China；3.Animal Science College，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350001，China）

To quantify the SD value of Staphylococcus aureus Reference Materials in chicken matrix，the S.aureus counting methods，the standard values and the uncertainty were analyzed in this study.As compared to the results of three different S.aureus counting methods，BP pouring counting method showed the same result with PCA counting method，The SD value of BP tablet pouring method was smaller as compared to BP tablet coating method.The BP tablet pouring counting showed good precision and reproducibility.The SD values was 275 CFU/bottles and the total uncertainty was 6，the Reference Materials constant value was（275+6）CFU/bottle.

Staphylococcus aureus，reference materials，fixed value，uncertainty

TS 201.6

A

1673—1689（2015）09—0972—06

2014-09-01

国家质检总局科技计划项目（2012IK149）。

郑洁（1981—），女，青海西宁人，高级工程师，主要从事分析化学研究。E-mail：2210646@qq.com

郑晶（1973—），女，福建福州人，理学硕士，研究员，主要从事食品微生物检测及其研究。E-mail：fjciqzj@qq.com