魔芋内生细菌抗软腐病菌株筛选

余 婷，林天兴,2，龚明福,2



魔芋内生细菌抗软腐病菌株筛选

余 婷1，林天兴1,2，*龚明福1,2

（1. 乐山师范学院生命科学学院，四川，乐山 614000；2. 峨眉山生物多样性保护与利用研究所，四川，乐山 614000）

通过组织分离法从魔芋块茎中分离得到内生细菌，用牛津杯法皿内测试内生细菌对魔芋软腐病菌的拮抗作用，以筛选拮抗软腐病菌能力强的菌株。结果显示从魔芋块茎中分离得到35株内生细菌，35株内生细菌对魔芋软腐病菌均有不同程度的拮抗活性，不同菌株间拮抗活性存在显著差异。初筛中，对软腐病菌相对抑制率（RIR）达到50%以上的内生细菌有17株，100%的有11株。复筛中RIR为100%的内生细菌有8株，其中7株胞外产物的RIR超过了150%。

魔芋；内生细菌；软腐病；胡萝卜软腐欧文氏菌

魔芋（）在中国广泛栽培，其球茎中葡甘聚糖含量非常丰富，已被广泛应用于食品、医药、化工和农业等行业中。魔芋软腐病是魔芋的主要病害，已经严重影响到魔芋的生产，它是魔芋产业发展的严重障碍。该病是由胡萝卜软腐欧文氏菌（subsp，ECC）引起的细菌性病害[1]。

近年来内生细菌作为植物病害防治和促进植物生长的新资源，它被越来越多的专家和学者所关注[2-3]。生活在魔芋组织中的内生细菌具有抗魔芋软腐病病菌的潜力，用植物内生细菌作为生物防治剂不仅能很好地适应植株体内的生活环境，并对维管束病害能够进行有效的抑制[4]，同时还不会对环境造成污染。目前已有许多利用内生细菌或其代谢物防治魔芋软腐病的研究报道[5-8]。

本课题组近年来分别从四川夹江县、峨眉山和沐川县魔芋块茎中分离得到了35株内生细菌，并对其拮抗魔芋软腐病菌的能力进行了测定。研究结果可以为高效抗魔芋软腐病菌内生菌菌株的筛选及魔芋软腐病的生物防治提供技术和理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养基

营养琼脂培养基（NA）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL，pH7.2~7.4，121 ℃灭菌30 min。

营养琼脂培养液（NB）：NA培养基中不加琼脂。

1.2 魔芋内生细菌的分离纯化

从四川夹江县、峨眉山和沐川县魔芋种植区采集魔芋块茎，进行表面消毒后将块茎打碎，打碎的组织液以倍比稀释的方法稀释至10-3浓度，取不同稀释度的组织液涂布接种于NA平板上，每平板接种100 μL，每种浓度接种3个平板，28 ℃培养1 ~2 d。将生长出的内生细菌单个菌落按照形态、颜色、透明度、大小等指标挑选并接种于NA平板上进一步纯化得到纯菌落后接种于NA斜面，28 ℃培养24 h后置4℃保藏备用。

1.3 拮抗性内生细菌的筛选

初筛：在NA 板涂布接种0.1 mL 软腐病菌培养液（109~1010cfu.mL-1）。取四个规格相同的灭菌牛津杯（内径6 mm、外径8 mm）均匀插入NA板之间并保证牛津杯不能接触到NA平板的底部。分装100 μL测试供试内生菌菌液于三个牛津杯中。最后一个牛津杯中装入100 μL的灭菌的菌液作为对照组，每处理重复3次， 28 ℃下培养48 h。48 h后测量抑菌圈的大小。内生细菌对病原细菌的拮抗活性用相对抑制率( relative inhibition ratio，RIR )表示。RIR用以下公式计算：RIR (%) = (DT-DCK)/ DCK×100%。其中DT表示内生细菌抑菌圈的直径，DCK表示牛津杯的外直径。RIR超过50%则被认为有显著的拮抗活性。

复筛：对初筛RIR值达50%以上的内生细菌菌株按牛津法皿内拮抗法再重复筛选1次，在复筛中RIR超过100%则被认为有显著的拮抗活性。

1.4 胞外产物的拮抗活性测定

将复筛中RIR超过100%的试验菌株按107CFU/mL浓度接种到100 mL NB培养液中，160 rpm 28 ℃振荡培养2 d。在12 000 rpm离心10 min，过滤上清液（0.22 μm孔径膜），获得的过滤液即为主要胞外产物。将0.1 mL的胞外产物滴加于琼脂培养基的表面以测试其有无抗菌活性。胞外产物的抗菌活性测定方法与初筛中描述的牛津杯法相同。

2 结果及分析

2.1 魔芋内生细菌的分离

从四川夹江县、峨眉山和沐川县魔芋块茎中分离得到35株内生细菌，分别编号为AKEB01~AKEB35，其中AKEB01~AKEB10分离于夹江县，AKEB11~AKEB25分离于峨眉山，AKEB26~AKEB35分离于沐川县。

2.2 拮抗性内生细菌的初筛

从魔芋中分离得到的35株内生细菌对魔芋软腐病病原细菌均存在一定的拮抗活性（见表1），不同菌株的抗菌活性具明显差异。初筛中RIR达50%以上内生细菌有17株，其中有11 株的RIR为100%，包括AKEB06、AKEB11、AKEB16、AKEB20、AKEB21、AKEB23、AKEB26、 AKEB28、AKEB32、AKEB33 和 AKEB35等菌株。RIR在50%~100%范围的菌株有6株，分别为AKEB01、AKEB13、AKEB14、AKEB19、AKEB 25和AKEB31。具显著拮抗活性的菌株比率为48.57%。

表1 魔芋内生细菌抗软腐病菌株初筛相对抑制率

2.2 拮抗性内生细菌的复筛

初筛中RIR 达50%以上的17株内生细菌菌株复筛时拮抗活性仍然较高(见表2)，不同菌株的拮抗活性有显著差异。其中有8株的RIR达100%，包括AKEB06、AKEB11、AKEB16、AKEB20、AKEB23、AKEB28、AKEB32和AKEB35。

表2 拮抗性内生细菌复筛相对抑制率

2.3 胞外产物的拮抗活性

8株复筛RIR达100%的内生细菌菌株的主要胞外产物拮抗活性相对较高 (见表3)。除AKEB11菌株外的所有实验菌株胞外产物的RIR均达150%以上。

3 小结与讨论

本研究获得的35株内生细菌，均是从健康魔芋球茎中分离得到的。结果显示所有从魔芋中分离得到的内生细菌，它对魔芋软腐病病菌都具有不同程度的拮抗作用。在初筛中有17株菌株的RIR达50%以上，在复筛中RIR达100%以上的菌株有8株，其中7株胞外产物的RIR达150%以上。

目前，拮抗细菌性病原的物质大多基于体外抗菌法从草药及其提取物中筛选获得[8-10]。本研究从魔芋中分离得到的内生细菌菌株表现出较好的拮抗活性，因此，从具有软腐病抗性的内生细菌菌株中筛选出对软腐病病菌具拮抗性的内生细菌有很好的发展前景。

表3 拮抗性内生细菌胞外产物相对抑制率

参考文献：

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[3] Marois J J,Johnston S A,Dunn M T,et al. Biological control of Verticillium wilt of eggplant in the field[J]. Plant Disease, 1982, 66(12): 1166-1168.

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SCREENING OF ENDOPHYTIC BACTERIA ISOLATED FROMAGAINST SOFT ROT DISEASE

*YU Ting1, LIN Tian-xing1,2, *GONG Ming-fu1,2

(1. College of Life Sciences, Leshan Normal University, Leshan, Sichuan 614000, China; 2. Research Institute Protection ＆ Utilization of Biodiversiyt in Mount Emei, Leshan, Sichuan 614000, China)

Endophytic bacteria lived inhave the potential of antagonistic bacterial pathogen activity against tosoft rot pathogensubsp( ECC). The paper was to study and analyze all strains of 35 endophytic bacteria isolated fromwith strong antagonistic effect against to ECC. The antagonistic bacterial pathogen activity of different bacterial strains were significantly different. The number of endophytic bacteria with relative inhibition ratio ( RIR ) more than 50 % in the first screening was 17, in which there was 11 strains with RIR more than 100 % in the first screening, 8 strains with RIR more than 100 % in the second screening. RIR of the crude extracellular product of seven strains was more than 150%.

; Endophytic bacteria; Soft rot disease;subsp

1674-8085(2015)06-0052-04

Q939.9

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.06.011

2015-06-17；修改日期：2015-08-17

四川省教育厅科研计划项目(15ZA0278，15TD0026)；乐山师范学院科研计划项目(Z1160)

余 婷(1995-)，女，四川成都人，乐山师范学院生命科学学院动植物检验检疫专业本科生 (E-mail:962440424@qq.com);

林天兴(1972-)，男，四川沐川人，副教授，硕士，主要从事微生物资源研究(E-mail:182476903@qq.com);

*龚明福(1970-)，男，四川邻水人，教授，硕士生导师，主要从事微生物资源研究(E-mail:gongmingfu98@163.com).