重楼叶多糖改善D-半乳糖衰老模型小鼠脾脏免疫功能和抗氧化能力

刘功成，王作伟，李亭亭，杜金莹，杜小刚，曹晓涵，曾宪垠

（四川农业大学生命科学院原子能农业应用研究室，四川雅安625014）

重楼叶多糖改善D-半乳糖衰老模型小鼠脾脏免疫功能和抗氧化能力

刘功成，王作伟，李亭亭，杜金莹，杜小刚，曹晓涵，曾宪垠*

（四川农业大学生命科学院原子能农业应用研究室，四川雅安625014）

采用D-半乳糖注射诱导衰老模型，探讨了重楼叶多糖（PPLPs）对小鼠脾脏免疫功能和抗氧化的影响。分别对小鼠D-半乳糖、D-半乳糖和PPLPs、D-半乳糖和VC以及生理盐水处理，持续42 d。结果显示：与模型组相比，灌胃PPLPs或VC均能显著增加小鼠脾脏指数（p＜0.05），显著上调脾脏免疫相关基因（T-bet、GATA、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4和IL-10）mRNA表达水平（p＜0.05），也显著增强了脾脏总超氧化物歧化酶（T-SOD）、铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）活性（p＜0.05）；同时，灌胃PPLPs或VC显著降低了脾脏丙二醛（MDA）含量（p＜0.05）。结果表明，PPLPs可增强脾脏免疫功能并提高小鼠的抗氧化活性。

重楼多糖，衰老，免疫，抗氧化，脾脏

目前，我国已进入人口老龄化的快速发展阶段。2010年，全国60岁以上的老年人口已接近2亿，预计到21世纪中叶，将达到4.5亿，约占总人口的1/3［1］。免疫学理论认为免疫功能的衰退是造成机体衰老的重要因素。另外，新陈代谢会产生活性氧（ROS），如超氧负离子自由基（O2-·）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH-）等。ROS可参与细胞内的信号传导，但过多的ROS会扰乱机体正常氧化/抗氧化平衡，损害与免疫相关细胞的蛋白质、脂质、核酸，从而破坏了免疫细胞的结构和功能，导致机体免疫功能下降［2］。因此，机体ROS含量与衰老可能存在着密切的关系。

多糖分布于植物、动物、微生物和藻类中，是维持生命机体正常运转的基本物质之一。研究表明，多糖具有免疫调节［3］、抗氧化［4］等功能，且由于多糖对细胞几乎没有毒副作用，现在越来越受到当今医药与食品行业的关注。重楼是一种传统中药，广泛分布于中国西南地区，具有消肿、缓解疼痛、有效治疗蛇虫咬伤及跌打损伤等作用［5］，并作为抗菌剂和止痛剂应用于临床［6-7］，但对于重楼多糖免疫调节作用的研究鲜见报道。

为此，本实验拟研究重楼多糖对小鼠脾脏免疫功能和抗氧化活性的影响，为寻找和开发新的安全、有效的免疫增强剂和天然抗氧化剂提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

昆明小白鼠成都达硕生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK（川）2013-24；重楼多糖四川农业大学生命科学院植物学系提供［8］；Trizol、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒宝生物工程（大连）有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA） 南京建成生物工程研究所。

CFX96荧光定量PCR仪百乐科技有限公司；UV-1100紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司；ST16R台式高速冷冻离心机北京联合科力科技有限公司；HH-4数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司；DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱上海齐欣科学有限公司。

1.2实验方法

1.2.1动物分组和处理实验选取7～8周体重25～30 g的健康雌性昆明小白鼠，40只小鼠适应性喂养1周后，随机分为4组，每组10只。其中第Ⅰ组，每天皮下注射0.2 mL生理盐水（0.9%）和灌胃0.25 mL蒸馏水，为正常对照组（Normal）；第Ⅱ组，每天皮下注射0.2 mL D-半乳糖［120 mg/（kg·d）］和灌胃0.25 mL蒸馏水，为模型组（Model）；第Ⅲ组，每天皮下注射0.2 mL D-半乳糖［120 mg/（kg·d）］和灌胃0.25 mL VC［200 mg/（kg·d）］，为阳性对照组（VC）；第Ⅳ组，每天皮下注射0.2 mL D-半乳糖［120 mg/（kg·d）］和灌胃0.25 mL重楼多糖［200 mg/（kg·d）］，为多糖处理组（PPLPs）。实验处理持续42 d，第43 d起禁食24 h，称重后脱颈处死所有实验鼠，收集小鼠脾脏组织，称重。将一部分脾脏组织进行匀浆、离心取均浆上清液（10 mg/mL），待测；另一部分脾脏组织液氮研磨，通过苯酚-氯仿法提取组织总RNA，电泳检测RNA以检测其完整性以及是否污染。

1.2.2脾脏指数的测定采用如下公式：脾脏指数（mg/g）=脾脏质量/小鼠体重［9］，计算小鼠脾脏指数。

1.2.3脾脏免疫功能相关基因的检测实时荧光定量PCR检测小鼠脾脏免疫功能（T-bet、GATA、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10）相关基因的表达量。所提取出来的RNA采用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，相关操作严格按照操作说明书进行。然后以cDNA为模板在特定引物下进行定量检测，每个样品重复3次。PCR程序为：95℃，10 s；然后进行40循环的PCR：95℃变性5 s，58～61℃退火+延伸25 s，最后进行溶解曲线以监测PCR扩增产物的特异性。目的基因mRNA相对表达水平采用标准曲线法进行计算。待检测基因及基因检测所采用的引物序列见表1。

表1　免疫功能相关基因及内参基因引物序列Table 1　The primer sequences of immunity-related and reference genes

1.2.4脾脏抗氧化酶及MDA含量测定总超氧化物歧化酶（T-SOD）和铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）：采用黄嘌呤氧化酶法；过氧化物酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）：采用紫外分光光度法；丙二醛（MDA）：采用硫代巴比妥酸法。脾脏蛋白含量采用紫外分光光度计法测定。以上测定均按照相应的试剂盒使用说明进行测定。

1.3数据的统计分析

利用SPSS 17.0统计学软件中ANOVA对所测数据进行单因子方差分析，采用LSD法进行数据间多重比较，结果以平均值±标准差表示，p＜0.05表示数据差异显著。

2　结果与分析

2.1小鼠体重及脾脏指数

脾脏是人体最大的淋巴器官和外周免疫器官，含有大量B细胞和T细胞，能产生与免疫调节有关的活性物质，是研究免疫系统的一个极其重要的组织［11-12］。如表2所示，与正常对照组相比，连续注射D-半乳糖显著降低了小鼠体重和脾脏指数（p＜0.05）。与模型组相比，连续灌胃PPLPs或VC均显著提高小鼠体重和脾脏指数（p＜0.05），且将脾脏指数维持在正常对照组水平（p＞0.05）。PPLPs组小鼠脾脏指数与VC组相比差异不显著（p＞0.05）。说明PPLPs和VC可以改善D-半乳糖引起的脾脏萎缩，明显提高D-半乳糖衰老模型小鼠脾脏指数，这与前人研究结果一致［13-14］。

表2　小鼠体重及脾脏指数（±s，n=10）Table 2　The body weights and spleen indices of mice（±s，n=10）

表2　小鼠体重及脾脏指数（±s，n=10）Table 2　The body weights and spleen indices of mice（±s，n=10）

注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。

组别　　体重（g）　　脾脏指数（mg/g）正常对照组　31.89±1.13b　4.13±1.09b模型对照组　29.02±1.67a　2.69±0.87aVC组　31.32±1.19b　4.08±0.92bPPLPs组　32.55±1.31b　3.96±1.13b

2.2小鼠脾脏免疫基因mRNA表达水平

小鼠脾脏免疫相关基因mRNA表达水平如图1所示。与正常对照组相比，连续注射D-半乳糖显著下调小鼠脾脏T-bet、GATA-3、IL-2、IL-10、IL-4和TNF-α及INF-γ mRNA表达水平（p＜0.05）。而连续注射D-半乳糖的同时灌胃VC或PPLPs，均能显著上调小鼠脾脏组织T-bet、GATA-3、IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α及INF-γ mRNA表达水平（p＜0.05），且VC组与PPLPs组的T-bet、GATA-3、IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α及INF-γ mRNA表达水平均无显著差异（p＞0.05）。上述结果说明，重楼多糖能通过提高体液免疫和细胞免疫作用而增强机体的免疫功能。这与封海波等报道的川牛膝多糖可以提高小鼠免疫功能相关基因表达水平的研究结果相一致［4］。

2.3小鼠脾脏抗氧化酶活性

小鼠脾脏组织抗氧化酶活性如图2所示。与正常对照组相比，连续注射D-半乳糖显著降低小鼠脾脏组织中T-SOD、CuZn-SOD、CAT和GSH-Px酶活（p＜0.05）。在连续注射D-半乳糖的同时灌胃PPLPs或VC均能显著提高小鼠脾脏T-SOD、CuZn-SOD、CAT、GSH-Px酶活（p＜0.05）。灌胃PPLPs与灌胃VC相比，除GSH-Px酶活无显著差异外（p＞0.05），灌胃VC组TSOD、CuZn-SOD、CAT酶活都显著高于灌胃PPLPs组（p＜0.05）。这些结果表明PPLPs可以通过提高抗氧化相关酶的活性，提高其抗氧化作用。这与李俊丽等的研究结果一致［15-16］。

图1　小鼠脾脏T-bet、GATA-3、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及INF-γ mRNA表达水平Fig.1　The mRNA expression levels of T-bet，GATA-3，IL-2，IL-4，IL-10，TNF-α and INF-γ in spleen tissue of mice

图2　小鼠脾脏T-SOD、CuZn-SOD、GSH-Px和CAT酶活Fig.2　Total superoxide dismutase and Cu，Zn superoxide dismutase in spleen tissue of mice

图3　小鼠脾脏MDA含量Fig.3　MDA contents in spleen tissue of mice

2.4小鼠脾脏MDA含量

D-半乳糖属生理性营养成分，进入机体后，在半乳糖酶的作用下，生成醛糖和过氧化氢，过氧化氢过量会使细胞膜的组成成分不饱和脂肪酸分解产生MDA，从而破坏细胞的结构和功能［17］。小鼠脾脏MDA含量如图3所示，与正常对照组相比，连续注射D-半乳糖显著增加小鼠脾脏组织MDA含量（p＜0.05），说明大量自由基的产生严重损伤机体，导致丙二醛（MDA）的产生和积累。与模型组相比，连续灌胃PPLPs或VC均显著降低小鼠脾脏组织MDA含量（p＜0.05），且PPLPs组与正常对照组无显著差异（p＞0.05）。PPLPs组与VC组间小鼠脾脏组织MDA含量无显著差异（p＞0.05）。表明VC可以抑制脂质过氧化产物MDA的产生。以上结果表明，重楼多糖可能通过抑制机体内的脂质过氧化，减轻对机体组织造成的氧化损伤，这与前人研究结果一致［16，18］。

3　结论与讨论

衰老的免疫学假说认为免疫功能的衰退是造成机体衰老的重要原因，免疫系统从根本上参与了机体的衰老过程［19］。目前衰老研究的模型中，D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠模型较为公认［20-21］，衰老的代谢学说认为衰老是机体代谢性障碍的结果。连续给动物注射D-半乳糖，在醛糖还原酶的催化下，还原成半乳糖醇，这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常的渗透压，导致细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱，最终导致衰老的发生［22］。故本实验以重楼多糖为研究材料，探讨了其对D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型小鼠脾脏免疫功能和抗氧化能力的影响。

初始T细胞分化为Th1或Th2的过程是受转录因子T-bet和GATA-3蛋白调控的。T-bet诱导T细胞分化为Thl细胞；GATA-3只在Th2型细胞中表达并调控相关细胞因子的分泌［21］。在分子免疫学上，Th1型细胞主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α，主要是通过细胞因子作用于巨噬细胞、NK细胞、CTL等细胞，提高其吞噬活性，发挥细胞免疫反应。Th2型细胞主要产生IL-4和IL-10，主要通过CK可刺激B淋巴细胞增殖并产生抗体，故其主要功能为辅助体液免疫反应［23］。连续42 d给雌性小鼠皮下注射D-半乳糖显著（p＜0.05）降低小鼠脾脏T-bet、GATA-3以及免疫相关基因（IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10）mRNA的表达。灌胃VC和PPLPs均可提高小鼠脾脏中T-bet、GATA-3以及免疫功能相关基因mRNA表达水平，这可能是PPLPs增强小鼠脾脏免疫功能的机理之一。

动物体内的抗氧化系统包括抗氧化酶（SOD、CAT）和GSH等抗氧化剂，它们可以及时清除体内多余的自由基，防止自由基对细胞产生损伤［24］。连续42 d给雌性小鼠灌胃D-半乳糖显著（p＜0.05）降低小鼠脾脏抗氧化物酶（T-SOD、CuZn-SOD、GSH-Px、CAT）活性，说明D-半乳糖在半乳糖酶作用下分解，产生过量自由基严重损伤细胞，导致脂质过氧化物—丙二醛（MDA）的产生。注射D-半乳糖的同时给小鼠灌胃VC，小鼠脾脏抗氧化酶活性、MDA含量保持在正常对照组小鼠水平，给小鼠注射D-半乳糖的同时灌胃PPLPs与灌胃抗氧化剂VC效果相当。因而推测重楼多糖可能通过提高超氧化物歧化酶活性，增强其对自由基的清除能力，抑制脂质过氧化，降低丙二醛含量，从而减轻对机体组织的损伤以延缓衰老。

综上所述，重楼多糖能显著增强小鼠脾脏免疫功能及抗氧化能力，可作为天然抗氧化剂的重要来源。

［1］曾尔亢，孙煜昊，段凌，等.我国人口老龄化与衰老科学［J］.中国社会医学杂志，2014，29（6）：388-389.

［2］Wang QS，Zhao XY，He SZ，et al.Differential proteomics analysis of specific carbonylated proteins in the temporal cortex ofagedrats：thedeteriorationofantioxidantsystem［J］. Neurochemical Research，2010，35（1）：13-21.

［3］WatanabeS，InoueJ.Intracellulardeliveryof lipopolysaccharide induces effective Th1-immune responses independent of IL-12［J］.PLoS One，2013，8（7）：e68671.

［4］封海波.川牛膝多糖对小鼠免疫反应的影响及机理研究［D］.雅安：四川农业大学，2013.

［5］Wen F，Yin H，Chen C，et al.Chemical characteristics of saponins from Paris fargesii var.brevipetala and cytotoxic activity of its main ingredient，paris saponin H［J］.Fitoterapia，2012，83（4）：627-635.

［6］Qian XP，Zhu LJ，Hu J，et al.Rhizoma Paridisethanol extract selectively inhibits the proliferation of HUVECs comparing to Lovo cells and shows anti-angiogenesis effects in a mouse model［J］.Journal of Ethnopharmacology，2012，143（1）：256-261.

［7］Qin XJ，Sun DJ，Ni W，et al.Steroidal saponins with antimicrobial activity from stems and leaves of Paris polyphylla var.yunnanensis［J］.Steroids，2012，77（12）：1242-1248.

［8］Shen SA，Chen DJ，Li X，et al.Optimization of extraction process and antioxidant activity of polysaccharides from leaves of Paris polyphylla［J］.Carbohydrate Polymers，2014，104：80-86.

［9］Zhang JL，Yu YC，Zhang ZF，et al.Effect of polysaccharide from cultured Cordyceps sinensis on immune function and antioxidation activity of mice exposed to60Co［J］.International Immunopharmacology，2011，11（12）：2251-2257.

［10］Petrov A，Beer M，Blome S.Development and validation of a harmonized TaqMan-based triplex real-time RT-PCR protocol for the quantitative detection of normalized gene expression profiles of seven porcine cytokines［J］.PLoS One，2014，9（9）：e108910.

［11］Tarantino G，Scalera A，Finelli C.Liver-spleen axis：intersection between immunity，infections and metabolism［J］. World Journal of Gastroenterology，2013，19（23）：3534-3542.

［12］雷超，张力华，苏婷.加味四君子汤对衰老大鼠的脾脏及细胞因子的影响［J］.中国中医药杂志，2014，29（9）：2941-2944.

［13］单颖，姜东，潘兴瑜，等.玉竹多糖干预后衰老模型鼠抗氧化系统及免疫功能的变化［J］.中国临床康复，2006，10（19）：146-148.

［14］Liu LN，Guo ZW，Zhang Y，et al.Polysaccharide extracted from Rheum Tanguticum prevents irradiation-induced immune damage in mice［J］.Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2012，13（4）：1401-1405.

［15］李俊丽，韩兴发，刘铁秋.川牛膝多糖对衰老小鼠模型的体内抗氧化作用［J］.中国抗生素杂志，2014，39（7）：553-559.

［16］Ji DB，Ye J，Li CL，et al.Anti-aging effect of Cordyceps sinensis extract［J］.Phytotherapy Research，2009，23（1）：116-122.

［21］任瑞琴，陈丹，程清，等.芙蓉李总多酚提取物对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠的抗氧化作用［J］.中国现代应用药学，2014，31（1）：5-9.

［18］蔡华珍，李冬雪，肖和平.乌鸡黑色素对D-半乳糖致衰小鼠抗氧化能力的影响［J］.中国老年学杂志，2014，34（5）：1277-1279.

［19］何敏，伍春，明海霞，等.甘肃党参水煎剂对D-半乳糖诱导衰老小鼠免疫功能的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（8）：794-797.

［20］秦红兵，杨朝晔，范忆江，等.D-半乳糖诱导衰老小鼠模型的建立与评价［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（7）：1275-1278．

［21］Lv LS，Gu XH，Tang J，et al.Antioxidant activity of stilbene glycoside from Polygonum multiflorum Thunb in vivo［J］.Food chemistry，2007，104（4）：1678-1681.

［22］陈勤.抗衰老研究实验方法［M］.北京：中国医药科技出版社，1996：46-47.

［23］Kuo HC，Guo MM，Liu SF，et al.Cross-fostering increases th1/th2 expression in a prenatal dexamethasone exposure rat model［J］.PLoS One，2014，9（12）：e115554.

［24］马宇光，杨帆，杨卫军.硫氧还蛋白的结构及在生物抗氧化中的功能［J］.生命的化学，2011，31（3）：429-433.

Effect of polysaccharides from the leaves of Paris polyphylla on immune function and antioxidant capacities of mouse spleen tissue in a D-galactose-induced aging mouse model

LIU Gong-cheng，WANG Zuo-wei，LI Ting-ting，DU Jin-ying，DU Xiao-gang，CAO Xiao-han，ZENG Xian-yin*
（Isotope Research Laboratory，College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

In the present study，the protective effects of polysaccharides from the leaves of Paris polyphylla（PPLPs）against aging in an accelerated aging mice model induced by D-galactose were investigated.A group of 2-month-old C57BL/6J mice were treated daily with D-galactose，D-galactose combined with PPLPs，D-galactose combined with vitamin C（VC），and control buffer for 42 d.The results showed that compared with the model group，oral administration of D-galactose-induced aging mice with either PPLPs or VCboth significantly increased spleen indices（p＜0.05），the mRNA expression levels of immune function related genes（T-bet，GATA，IFN-γ，IL-2，TNF-α，IL-4，and IL-10）（p＜0.05）and the total superoxide dismutase（T-SOD），CuZn superoxide dismutase（CuZn-SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and catalase（CAT）in spleen tissue were significantly higher in both PPLPs and VCgroup than those in the model group（p＜0.05）；besides，the malondialdehyde（MDA）concentrations were decreased in PPLPs and VCgroup compared to those in the model group（p＜0.05）.The results indicated that PPLPs was able to enhance the immune function and improve the antioxidant capacities of mouse spleen tissue.

PPLPs；aging；immunity；antioxidantation；spleen

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0366-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.066

2015-01-16

刘功成（1988-），男，硕士研究生，研究方向：分子生物物理学，E-mail：liugongcheng@126.com。

曾宪垠（1966-），男，博士，研究员，研究方向：动物生理与生殖免疫调控，E-mail：xyzeng1966@163.com。