山楂中齐墩果酸和熊果酸超声提取工艺研究

孙协军，刘羽纯，潘龙飞，薛晓霞，李秀霞

（渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”，辽宁锦州121013）

山楂中齐墩果酸和熊果酸超声提取工艺研究

孙协军，刘羽纯，潘龙飞，薛晓霞，李秀霞*

（渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”，辽宁锦州121013）

对山楂齐墩果酸和熊果酸超声波辅助提取工艺进行了优化，以齐墩果酸和熊果酸总含量为响应值，考查了液固比、超声波功率和提取时间对山楂总齐墩果酸和熊果酸含量的影响。结果表明，三个考查因素对山楂齐墩果酸和熊果酸含量影响的顺序为：液固比＞提取时间＞超声波功率；方差分析结果表明，液固比和提取时间对齐墩果酸和熊果酸含量有极显著影响（p＜0.01），超声波功率对齐墩果酸和熊果酸含量有显著影响（p＜0.05），提取时间的二次项对齐墩果酸和熊果酸含量有极显著影响（p＜0.01），各因素之间交互作用不显著（p＞0.05）；确定超声波辅助提取山楂齐墩果酸和熊果酸的最佳工艺参数为：乙醇体积分数90%，液固比35∶1mL/g，超声波功率352W，提取时间为4.6min，在优化工艺条件下超声波辅助提取山楂齐墩果酸和熊果酸，其含量为2.87mg/g，与预测值相符。本实验中所用提取方法在显著节约了超声波处理的时间同时也获得了良好的提取效率。

山楂，齐墩果酸，熊果酸，超声波提取

山楂通常指蔷薇科植物山里红（Crataegus Pinnatifida Bga.var.major N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的果实。其中，山里红也叫北山楂，在我国北方地区广泛栽培，是重要的药食同源植物［1］。山楂果实富含糖、黄酮类物质、三萜类化合物、柠檬酸和维生素等多种营养和功效成分［2］，三萜类化合物是山楂中的一类重要的活性组分，其母核为30个碳原子构成的碳架，大多数三萜类化合物由6个异戊二烯单体连接而成，常见的有四环三萜类和五环三萜类［3］，山楂酸（maslinic acid）、科罗索酸（corosolic acid）、齐墩果酸（oleanolic acid）和熊果酸（ursolic acid）为代表的五环三萜是山楂中主要的三萜类化合物［4］，山楂中含量最高的三萜类化合物为熊果酸［5］，齐墩果酸是熊果酸的同分异构体，熊果酸和齐墩果酸具有抗炎、增强免疫、抗肿瘤、保肝和抗菌等重要生理功能［6］。

索氏提取［7］、回流提取［8］、超声波提取［9］、微波辅助提取［10］、超高压提取［11］及超临界流体萃取［12］等方法是齐墩果酸和熊果酸等三萜酸常用的提取方法。超声波辅助提取方法的提取效率高于索氏抽提［7］和回流提取［13］等传统方法，但是现有的超声波辅助萃取齐墩果酸或熊果酸的研究报道中，大部分耗时较长［13-15］，超声波破碎仪在细胞破壁方面具有较高效率，超声波探头与物料直接接触，应用于生物活性成分提取中，传质效率更高，可能会在短时间内获得较好的提取效率。因此，本实验以自制山楂粉为原料，采用超声波辅助溶剂萃取技术，对山楂中齐墩果酸和熊果酸的提取工艺进行研究，为超声波技术在三萜酸等活性成分提取方面的应用提供技术依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

山楂市售，产自辽西地区；齐墩果酸标准品（含量94.9%）和熊果酸标准品（含量99.3%） 购于中国药品生物制品检定所；色谱甲醇、磷酸天津大茂化学试剂厂；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

P680型高效液相色谱仪（配DAD检测器） 美国戴安公司；FA2004型电子天平上海恒平科学仪器有限公司；RE-2000型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞破碎仪宁波新芝超声设备有限公司；PS02-AD-DI型超纯水机上海讯辉环保科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵上海申光仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1山楂样品预处理方法选择整齐度良好的新鲜山楂自来水清洗后去除果核，带皮果肉部分在50℃热风烘干后粉碎成细粉，全部过40目分样筛后真空封装，冷藏备用。

1.2.2山楂齐墩果酸和熊果酸提取方法参考董海丽［11］提取方法，略有改动。准确称取一定质量山楂粉于200mL玻璃烧杯中，按照实验设计加入相应体积的提取溶剂混合后，将超声波破碎仪的探头置于烧杯溶液的液面下1.5cm处，设定适当的超声波功率下，超声2s/间歇2s，超声波处理一定时间后，提取后的混合液减压抽滤，等体积的提取溶剂洗涤抽滤瓶中滤渣，所得滤液在60℃旋转蒸发掉大部分溶剂后，无水乙醇溶解并定容至10mL，0.45μm膜过滤后，HPLC检测齐墩果酸和熊果酸浓度，分别计算其含量。

1.2.3液相色谱检测条件色谱条件的确定Develosil C30（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：甲醇：0.1%磷酸水溶液（90∶10；v/v）；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样20μL；检测波长：202nm。

1.2.4标准溶液的配制各取齐墩果酸和熊果酸标准品10.5mg和20mg，甲醇溶解并分别定容至25mL，得到浓度分别为0.42（齐墩果酸）和0.8（熊果酸）mg/mL的混合标准品贮备液，分别稀释为5个浓度梯度的标准使用溶液，浓度分别为：齐墩果酸，0.084、0.168、0.252、0.336、0.420mg/mL；熊果酸，0.16、0.32、0.48、0.64、0.80mg/mL。

1.2.5齐墩果酸和熊果酸含量计算方法

式中，c为HPLC检测到的齐墩果酸和熊果酸浓度；v为定容体积，本实验中为10mL；m为称样质量，g。

1.2.6提取单因素实验设计

1.2.6.1乙醇体积分数对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响准确称取5g山楂粉于200mL烧杯中，分别加入体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液各100mL，在超声波功率为500W条件下提取5min，参照1.2.2所述方法进行超声波提取实验，计算齐墩果酸和熊果酸含量。

1.2.6.2液固比对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响准确称取适量山楂粉于200mL烧杯中，分别加入无水乙醇150mL使其液固比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1mL/g，设定超声波功率500W，提取时间5min，参照1.2.2所述方法进行超声波提取实验，计算齐墩果酸和熊果酸含量。

1.2.6.3超声波功率对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响准确称取5g山楂粉于小烧杯中，按上述优化出的液固比加入无水乙醇溶剂，在超声波功率约分别为200、300、400、500、600W条件下分别提取5min，参照1.2.2所述方法进行超声波提取实验，计算齐墩果酸和熊果酸含量。

1.2.6.4超声波作用时间对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响准确称取5g山楂粉于200mL中，在上述优化的液固比和超声波功率条件下分别提取2、4、6、8、10min，参照1.2.2所述方法进行超声波提取实验，计算山楂齐墩果酸和熊果酸含量。

1.2.7响应面实验设计为进一步确定最佳超声波提取条件和各因素的影响顺序，依据Design-expert 8.0.6进行响应面实验设计，以齐墩果酸和熊果酸总含量为考察指标，以液固比（X1）、超声波功率（X2）和提取时间（X3）为考查因素，共设立20个处理组，具体实验设计见表1，每个处理平行测定1次，结果取平均值。

表1　山楂齐墩果酸和熊果酸超声波辅助提取响应面实验设计Table 1　Response surface experiment design of ultrasoundassisted extraction of hawthorn oleanolic acid and ursolic acid

1.3数据统计分析

实验数据采用Excel 2003和Design-Expert 8.0.6数学软件进行分析。

2　结果与分析

2.1HPLC分离结果和标准曲线的建立

齐墩果酸和熊果酸混合标准溶液及山楂提取液的液相色谱图见图1和图2所示，齐墩果酸和熊果酸是山楂中互为同分异构体的2种三萜类化合物，参照其他研究者的报道［16］和齐墩果酸及熊果酸单独进样时保留时间的数据，确认保留时间为20min左右色谱峰为齐墩果酸，保留时间为22min左右色谱峰为熊果酸。

图1　齐墩果酸和熊果酸混合标准溶液色谱图Fig.1　Chromatogram of oleanolic acid and ursolic acid mixture

图2　山楂齐墩果酸和熊果酸提取液色谱图Fig.2　Chromatogram of hawthorn oleanolic acid and ursolic acid extract

2.2乙醇体积分数对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响

乙醇体积分数对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响如图3所示，在乙醇体积分数90%以下时，山楂齐墩果酸和熊果酸含量随着乙醇体积分数的增加而增加，体积分数为90%乙醇时提取效果和无水乙醇相似，这与黎海彬采用回流方法提取熊果酸、颜廷才等采用超声波辅助法提取齐墩果酸的结果及李坤平等采用超声波法提取姜味草中熊果酸和齐墩果酸的实验结果近似［13，17-18］，而霍文兰［15］采用超声波辅助法提取山楂三萜酸时，提取齐墩果酸和熊果酸的最佳溶剂分别为体积分数为70%和80%乙醇，这可能与超声波功率不同有关，一般植物原料在较低体积分数的乙醇溶液中分散性较好，本实验中选取的超声波功率为500W，较高的超声波功率增加了90%乙醇和无水乙醇的传质效率，降低了分散性不好带来的影响，而较高体积分数的乙醇溶液同时对齐墩果酸和熊果酸具有更好的溶解能力，从而获得较好的提取效率。从成本考虑，选用乙醇体积分数为90%进行以下单因素和响应面实验。

图3　乙醇体积分数对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响Fig.3　Effect of ethanol volume fraction on content of oleanolic acid and ursolic acid extracted from hawthorn

2.3液固比对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响

液固比对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响如图4所示，随着液固比的增大，山楂齐墩果酸和熊果酸含量在一定范围内（液固比10∶1～30∶1mL/g）有增加的趋势，当液固比为30∶1mL/g时，含量最高（1.29mg/g），其后，随着液固比的增加，山楂齐墩果酸和熊果酸含量呈现下降趋势。这可能是因为随着液固比的增加，后继处理时间增长，在浓缩等过程中齐墩果酸和熊果酸的损失增加，因此，当液固比超过30∶1mL/g后，随着液固比的继续增大，山楂齐墩果酸和熊果酸含量反而有下降的趋势，因此，选择液固比30∶1mL/g进行下一步实验。

图4　液固比对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响Fig.4　Effect of solvent to solid ratio on content of oleanolic acid and ursolic acid extracted from hawthorn

2.4超声波功率对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响

超声波功率对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响如图5所示，超声波功率在200～400W范围内，山楂齐墩果酸和熊果酸提取效率随着超声波功率的增加而增加，在超声波功率为400W时，山楂齐墩果酸和熊果酸含量达到1.85mg/g，在高于400W后，山楂齐墩果酸和熊果酸提取效率迅速降低，说明较高的超声波功率对齐墩果酸和熊果酸有较强的破坏作用，在超声波辅助提取齐墩果酸或熊果酸的研究报道中，在采取低于300W的超声波功率时，通常需要较长的提取时间（20～50min）才能达到较好的提取效果［15，18-19］。因此，选择超声波功率为400W。

图5　超声波功率对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响Fig.5　Effect of ultrasonic power on content of oleanolic acid and ursolic acid extracted from hawthorn

2.5提取时间对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响

提取时间对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响如图6所示，在实验设定的2～4min提取时间内，齐墩果酸和熊果酸含量呈现增加的趋势，最大值出现在提取时间为4min时，此时齐墩果酸和熊果酸的含量为2.19mg/g，显著高于提取时间为2min时（p＜0.05），而提取时间超过4min后，齐墩果酸和熊果酸含量开始下降，本实验设定的超声波功率为400W左右，最佳提取时间为4min，所需时间较短［13，20］，研究表明超声波功率为75W条件下，需要提取时间为50min可获得较好提取效率［20］，说明本实验中较高的超声波功率是所需提取时间较短的主要原因。

图6　提取时间对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响Fig.6　Effect of extraction time on oleanolic acid and ursolic acid content extracted from hawthorn

表2　响应面实验结果及分析Table 2　Results and analysis of response experiment

表3　方差分析结果Table 3　Analysis of variance analysis results

2.6响应面实验结果

通过单因素实验，选取液固比（X1）、超声波功率（X2）和提取时间（X3）进行三因素三水平的响应面实验，实验设计的因素、水平和实验结果见表2。

用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行多元回归拟合，得到山楂中齐墩果酸和熊果酸含量的回归方程如下：Y=2.71+0.21X1-0.15X2+0.17X3+0.06X1X2+ 0.05X1X3-0.05X2X3-0.05X12-0.06X22-0.21X32，剔除不显著项后的回归方程为：Y=2.71+0.21X1-0.15X2+ 0.17X3-0.21X32。

方差分析结果见表3所示，模型的F值极显著（p＜0.01），而失拟的F值不显著（p＞0.05），模型的相关系数R2为87.16%，说明模型拟合程度较好，可以用该模型方程来分析和预测不同超声波辅助提取条件下山楂齐墩果酸和熊果酸含量的变化。在所选的各因素水平范围内，液固比（X1，mL/g）和提取时间（X3，min）对山楂齐墩果酸和熊果酸含量有极显著影响（p＜0.01），超声波功率（X2，W）对山楂齐墩果酸和熊果酸含量有显著影响（p＜0.05），各因素间交互作用不显著（p＞0.05），提取时间的二次项（X32）对山楂齐墩果酸和熊果酸含量有显著影响（p＜0.01），3个考查因素对山楂中齐墩果酸和熊果酸类化合物含量的影响排序为：液固比＞提取时间＞超声波功率。

2.7响应面图分析

从图7中可以看到随着液固比、超声波功率和提取时间增加，山楂齐墩果酸和熊果酸含量的变化情况，从图7（a）和图7（b）可以看出，当其他条件不变时，随着液固比的增加，齐墩果酸和熊果酸含量呈现逐渐增加并变缓的趋势，且变化幅度较大，说明在实验选取的液固比范围内，较高的液固比有利于提取效率的提高；而当液固比和提取时间不变时，随着超声波功率的增加，齐墩果酸和熊果酸含量先是缓慢增加而后迅速降低（见图7（a、c）），说明较好的山楂齐墩果酸和熊果酸提取效率需要一个适合的超声波功率，从较缓和的坡度来看，超声波功率对山楂齐墩果酸和熊果酸的影响低于液固比和提取时间的影响；从图7（b）和图7（c）中可以看出，在超声波功率和液固比一定的情况下，提取时间对齐墩果酸和熊果酸含量有较大影响，达到最大提取效率后，增加提取时间会降低齐墩果酸和熊果酸含量；综合表3方差分析结果和图7响应面图结果，可以看出液固比和提取时间对齐墩果酸和熊果酸含量的影响大于超声波功率，而三个因素间没有显著的交互作用。

2.8最优提取工艺参数的优化

采用Design Expert 7.0软件对工艺参数进行优化，得到的最佳工艺参数为：液固比35∶1mL/g，超声波功率355W，提取时间为4.6min，山楂齐墩果酸和熊果酸含量预测值为2.98mg/g。由于实验所用仪器原因，超声波功率更改为352W，在优化工艺条件下超声波辅助提取山楂齐墩果酸和熊果酸，其含量为2.87mg/g，与预测值的相对误差为3.69%。与已有的研究报道相比，本实验结果具有效率高和耗时短的优点，具有一定的应用价值。

图7　液固比（X1）、超声波功率（X2）和提取时间（X3）对山楂齐墩果酸和熊果酸含量影响的响应曲面图Fig.7　Response surface graph of the ratio of liquid to solid，ultrasonic power，and extraction time on oleanolic acid and ursolic acid content of hawthorn extracts

3　结论

以齐墩果酸和熊果酸总含量为衡量指标，对山楂齐墩果酸和熊果酸超声波辅助提取工艺进行了研究，考查了乙醇体积分数、液固比、超声波功率和提取时间对山楂齐墩果酸和熊果酸含量的影响，建立了超声波辅助提取山楂齐墩果酸和熊果酸的数学模型，确定超声波辅助山楂齐墩果酸和熊果酸的最佳工艺参数为：乙醇体积分数90%，液固比35∶1mL/g，超声波功率352W，提取时间为4.6min，在优化工艺条件下超声波辅助提取山楂齐墩果酸和熊果酸，其含量为2.87mg/g。

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Optimization of extracting technique assisted by ultrasound-assisted extraction of oleanolic acid and ursolic acid from hawthorn

SUN Xie-jun，LIU Yu-chun，PAN Long-fei，XUE Xiao-xia，LI Xiu-xia*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Engineering and Technology Research Center of Food Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

Extracting technique assisted by ultrasonic extraction method of oleanolic acid and ursolic acid from hawthorn was optimized.The total content of oleanolic acid and ursolic acid was used as response value，ratio of liquid to solid，ultrasonic power，and extracting time were investigated in this experiment.The results showed that the sequence of different factors on triterpene content was：ratio of liquid to solid＞extracting time＞ultrasonic power.The results of variance analysis showed that ratio of liquid to solid and extracting time had extremely significant effect on oleanolic acid and ursolic acid content（p＜0.01），ultrasonic power had a significant influence on oleanolic acid and ursolic acid content（p＜0.05），extracting time of the quadratic term had extremely significant effect（p＜0.01）.There was no interaction effect between each factor（p＞0.05）.The optimal condition was that ethanol volume percentage 90%，ratio of liquid to solid 35∶1mL/g，ultrasonic power 352W，extracting time 4.6min.Under the optimal condition，the oleanolic acid and ursolic acid content of hawthorn was 2.87mg/g，which was consistent with the predicted value.Extraction method using in this experiment demonstrated high extraction efficiency and shorter time simultaneously.

hawthorn；oleanolic acid；ursolic acid；ultrasound-assisted extraction

TS219

B

1002-0306（2015）14-0321-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.057

2014－10－20

孙协军（1969-），男，大学本科，实验师，主要从事食品资源开发利用方面的研究。

李秀霞（1973-），女，博士，副教授，主要从事水产品贮藏加工方面的研究。

辽宁省食品安全重点实验室开放课题（LNSAKF2011015）。