熊果酸对舌鳞癌Tca8113细胞增殖及凋亡的作用研究

李青岭，吴建勇，赵德璋（重庆医科大学生命科学研究院，重庆400016）

舌鳞癌的治疗多以手术切除为主，但可导致患者面部畸形和功能障碍，影响患者的生活质量。因此，寻找新型、高效、低毒的化疗药物对舌鳞癌的综合治疗具有重要意义。熊果酸是广泛存在于天然植物中的一种三萜类化合物，具有抗炎、抗氧化、降血脂等多种药理学效应。近年来发现，熊果酸还可抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移并诱导凋亡[1-5]。为探讨该成分对舌鳞癌细胞的增殖及凋亡的作用，本研究以舌鳞癌细胞株Tca8113为研究对象，观察不同浓度熊果酸对Tca8113细胞的增殖、凋亡的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Tca8113细胞由四川大学华西口腔医院惠赠。熊果酸（南京替斯艾么中药研究所，批号：TCM-036，纯度98%），用二甲基亚砜（DMSO）配成1 mmol/L的贮存液；RPMI-1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；Hoechst333258检测试剂盒购自南京凯基生物技术公司；AnnexinⅤ-异硫氰酸荧光素（AnnexinⅤ-FITC）检测试剂盒购自美国BIPEC生物试剂公司；Rhodamine123和caspase 3活性检测试剂盒购自北京碧云天生物技术公司；iQ SYBR Green supermix购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与细胞分组 细胞接种于RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清及青霉素、链霉素各100 U/mL），置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养。传代至细胞状态稳定后，将细胞按要求分组如下：阴性对照组，熊果酸低、中、高剂量处理组（10、20、40 μmol/L）。将上述细胞培养24 h后，按分组要求加入不同剂量的熊果酸作用24 h后，测定各项试验指标。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性 取对数生长期细胞，调整细胞浓度为每毫升4×104个，接种于96孔板中，每孔150 μL。培养24 h后按分组要求加入不同剂量的熊果酸，溶剂对照组加等体积的DMSO，每组设5个复孔。培养 24 h 后，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，继续培养4 h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL DMSO，振荡，使结晶充分溶解，采用酶标仪测定492nm处各孔吸光度（A）值。存活率=A药物组/A对照组×100%。

1.2.3 荧光染色法观察细胞DNA损伤 根据Hoechst 333258染色试剂盒说明书操作。取对数生长期细胞接种于24孔培养板，培养24 h后按分组要求给予不同的处理因素，继续培养24 h，荧光显微镜检测蓝色的细胞核。激发波长在350 nm左右，发射波长在460 nm左右。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将各处理组细胞用胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤2次后重悬并计数。取 1×106个细胞离心后，加入 400 μL Binding buffer重悬细胞，并加入10 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶（PI），轻轻混匀，避光室温反应20 min后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 Real-time PCR法检测Bcl-2和Bax mRNA的表达 用TRIzol抽提各处理组细胞总RNA，逆转录为互补 DNA（cDNA），取适量 cDNA为模板，Real-time PCR法扩增Bcl-2和Bax基因片段。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，进行组间差异比较。引物如下：Bcl-2 F：5′-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′；Bcl-2 R：5′-TCACTTGTGGCTCAGATAGG-3′；Bax F：5 ′-GCGTCCACCAAG AAGCTGAG-3′；Bax R：5′-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3′；GAPDH F：5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′；GAPDH R：5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。PCR扩增条件：95 ℃ 3 min，1 个循环；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，40个循环。

1.2.6 细胞线粒体膜电位检测 收集各处理组细胞，加入5 mg/L的Rhodamine123 50 μL，轻轻弹匀，37℃避光孵育30 min（每隔10 min振摇1次），PBS洗涤细胞，流式细胞仪（EX488 nm，Em534 nm激光）检测线粒体膜电位的变化。

1.2.7 casepase-3酶活性检测 不同浓度熊果酸处理细胞24 h后，胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤1次。根据试剂盒说明书操作，按照一定比例加入适量的细胞裂解液，冰浴裂解细胞15 min，4℃离心15 min。将裂解上清液转移至4℃预冷的离心管中，立即采用酶联免疫吸附试验测定caspase-3酶活性，同时用Bradford法测定蛋白浓度。将检测缓冲液、待测样品和Ac-DEVD-pNA混匀后，37℃孵育，待颜色明显变化时立即测定A405。通过与标准曲线对比，检测各组细胞中caspase-3的酶活性。

1.3 统计学处理 应用SPSS12.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用One-way ANOVA检验。Р＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 熊果酸对细胞生长增殖的影响 通过MTT法观察不同浓度熊果酸对细胞生长增殖的影响，结果显示，熊果酸对Tca8113细胞增殖具有明显的抑制作用，熊果酸各剂量组与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而且随药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强，见表1。

表1 熊果酸对Tca8113细胞增殖的影响（±s，n=5）

表1 熊果酸对Tca8113细胞增殖的影响（±s，n=5）

注：与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；-表示未使用熊果酸。

组别对照组熊果酸组剂量（μmol/L）存活率（%）-10 20 40 100.4±3.2 83.3±5.2a 64.7±6.8b 38.5±7.3b

2.2 熊果酸对细胞DNA损伤的影响 荧光显微镜下观察，活细胞的细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光；凋亡细胞的细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光，DNA发生损伤。与阴性对照组比较，熊果酸各处理组正常细胞的比例逐渐减少，DNA损伤逐渐增强，40 μmol/L处理组损伤最为明显。研究结果表明，熊果酸可以导致DNA发生损伤，诱导细胞发生凋亡。见图1。

图1 熊果酸对Tca8113细胞形态学的影响（200×）

2.3 熊果酸对细胞凋亡率的影响 AnnexinⅤ-FITC和PI双染各处理组细胞，流式细胞仪检测得到细胞凋亡百分率。结果显示，熊果酸各处理组凋亡率分别为（10.23±1.25）%、（18.93±0.92）%、（43.75±3.18）%，与阴性对照组（3.28±0.32）%比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2。表明熊果酸具有明显促细胞凋亡作用，且具有一定的剂量依赖性。

图2 熊果酸对Tca8113细胞凋亡率的影响

2.4 熊果酸对细胞Bcl-2和Bax mRNA表达的影响熊果酸药物处理24 h后，Real-time PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的表达，结果显示，与阴性对照组比较，各熊果酸药物处理组Bcl-2 mRNA表达量下降，中、高剂量药物处理组Bax mRNA表达量升高，Bcl-2/Bax比值显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3。表明熊果酸可能通过改变Bcl-2/Bax基因表达，激活线粒体途径诱导细胞发生凋亡。

图3 熊果酸对Tca8113细胞Bcl-2和Bax mRNA表达的影响

2.5 熊果酸对细胞线粒体膜电位（△Ψm）的影响 结果显示，10 μmol/L熊果酸低浓度处理组△Ψm为（73.73±3.14）%，与阴性对照组（64.31±3.25）%比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中、高剂量处理组与阴性对照组比较，△Ψm 分别上升为（96.28±6.09）%和（134.88±9.76）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明熊果酸可能通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡。

2.6 熊果酸对细胞caspase-3酶活性的影响 结果显示，熊果酸药物处理24 h后，低、中、高剂量药物处理组酶活性分别提高到（0.218±0.009）、（0.388±0.007）和（0.523±0.012），与对照组（0.076±0.005）比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），且酶活性与药物浓度呈正相关。

3 讨 论

从天然植物中提取高效低毒的抗肿瘤药物是目前临床药理学研究的热点之一。研究表明，熊果酸广泛存在于木犀科植物女贞叶中，能够抑制多种细胞系起源的肿瘤细胞的增殖[1-5]，提示其可以作为一种潜在的肿瘤治疗药物。本实验利用MTT法检测细胞增殖情况，结果显示，熊果酸对Tca8113细胞增殖具有明显的抑制作用。荧光显微镜下观察可见熊果酸药物处理组细胞呈现皱缩、变圆、脱落、细胞核染色质凝集、核固缩等凋亡细胞形态特征，结果与AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞仪分析细胞凋亡情况一致，表明熊果酸可以抑制Tca8113细胞增殖并促进其发生凋亡。

Mao等[6]研究认为，细胞凋亡的发生是多基因参与的级联反应的结果，药物诱导肿瘤细胞的凋亡受多基因的调控。线粒体和caspase蛋白酶家族是细胞凋亡途径中的两个调控点，对细胞线粒体凋亡途径的激活起着极其重要的作用[7-9]。当外界刺激启动凋亡时，Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax与线粒体外膜结合，并与抑凋亡蛋白Bcl-2形成异源二聚体，Bcl-2/Bax基因表达蛋白比例失调，引起线粒体膜电位改变，线粒体外膜通透性增加，导致凋亡因子如细胞色素C释放入细胞质，激活caspase蛋白酶家族启动凋亡级联反应，诱导细胞发生凋亡[10-14]。本实验结果显示，熊果酸作用Tca8113细胞后，可导致细胞Bax mRNA表达明显增加，Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax表达比例明显下降，线粒体膜电位明显增高，caspase-3酶活性显著增强。结果表明，熊果酸诱导Tca8113细胞发生凋亡与其调节Bcl-2和Bax表达水平以及caspase-3蛋白酶活性有关。

综上所述，熊果酸对舌鳞癌Tca8113细胞具有明显抑制增殖及促凋亡作用，其机制可能是通过启动细胞线粒体应激途径，降低Bcl-2/Bax表达比例，提高细胞线粒体膜电位，增强caspase-3蛋白酶的活性，从而诱导Tca8113细胞发生凋亡。这一机制可能为熊果酸治疗舌鳞癌的临床应用带来有意义的启示。

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