响应面法优化沙米总黄酮提取工艺的研究

张中华杨爱梅

（甘肃省中医院药学部1 兰州理工大学生命科学与工程学院2 甘肃 兰州 730050）

响应面法优化沙米总黄酮提取工艺的研究

张中华1，2杨爱梅2

（甘肃省中医院药学部1 兰州理工大学生命科学与工程学院2 甘肃 兰州 730050）

目的：采用双水相法萃取沙米中总黄酮，通过响应面法优化获得最佳萃取工艺条件。方法：采用无水乙醇（C2H5OH）/硫酸铵（（NH4）2SO4）双水相体系分离沙米中的黄酮，通过单因素试验和Box-Benhnken实验设计探讨黄酮粗提液质量分数、NaCl质量分数和pH值对萃取效果的影响。结果：最佳萃取条件为：黄酮粗提液质量分数13.88%、NaCl质量分数2%、pH8，在此条件下，沙米中总黄酮主要分布在上相，萃取率可达到91.29%。结论：在此条件下进行验证实验，结论与理论值基本吻合，表明该模型合理有效。

响应面法；双水相体系；沙米；总黄酮

沙米（Agtiopllyllum squarrosum） 属黎科沙蓬属的种子，又称沙蓬，主要分布于中国东北、华北、西北及河南等地区，是一种耐寒、耐旱的沙生植物。作为沙漠野生植物，安全、营养、无污染，中医中称之为天然减肥食品和心脑血管、肾脏功能减退、糖尿病人的理想食品［1］，故沙米是一种“药食同源”的绿色食品。而其中有一种重要营养成分黄酮。沙米中黄酮分子量小，能被人体吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消疲活脑、抗脂肪氧化、抗衰老、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细管疏通微循环的功能。黄酮类化合物还具有抗癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖等作用［2］。因此，越来越多的植物黄酮被开发并应用到食品添加剂、医药以及化妆品等行业［3］。

本试验采用C2H5OH/（NH4）2SO4双水相体系萃取沙米中的黄酮。分别考察了C2H5OH质量分数，（NH4）2SO4质量分数，NaCl质量分数，粗提液质量分数，pH对沙米黄酮萃取率的影响，对影响萃取率的三因素进行Box-Benhnken实验，获取最佳萃取条件。目前沙米黄酮提取尚未见报道，如果能够对其加以开发利用，可以充分利用沙漠野生资源。本实验对沙米总黄酮的提取工艺进行了研究，以便为更好地开发利用野生沙米资源提供可靠依据。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

沙米（粉末），C2H5OH、（NH4）2SO4、氯化钠均为分析纯。722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司制造）；超声波微波组合系统（南京先欧仪器制造有限公司）；电子天平（梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司）；超级恒温水浴（扬州市三发电子有限公司）；循环水真空泵（巩义市京华仪器有限责任公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 粗提液制备

称取沙米6.0g，溶于60mL50%C2H5OH中，超声辅助提取10min，抽滤，得粗提液。

1.2.2 标准曲线的制作

本文采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系络合化学吸光法［4］测定黄酮含量，510nm处测定吸光值。利用陈阳等方法获得标准曲线方程为：Y=1.2450X-0.0024（R2=0.99920）。

1.2.3 双水相萃取方法

称取一定量的C2H5OH、（NH4）2SO4和粗提液，使总体系达到10.0g，溶解混合，在一定条件下静置形成双水相体系，所得体系总黄酮富集于上相，下相为（NH4）2SO4相。待萃取完成后，准确测定上、下相体积，求萃取率。相比R=Vt/Vb；

分配系数K=Ct/Cb；萃取率Y%=KR/（KR+1）×100%（Vt为上相体积/ml；Vb为下相体积/ml；Ct为上相黄酮浓度/（mg/ml）；Cb 为下相黄酮浓度/（mg/ml））。

1.2.4 单因素实验

分别取不同的C2H5OH质量分数、（NH4）2SO4质量分数、粗提液质量分数、NaCl质量分数、pH值测其黄酮含量，以选择最佳的各单因素取值范围。

1.2.5 Box-Benhnken实验设计及验证实验

在单因素基础上，以粗提液质量分数、NaCl质量分数、pH值为影响因素，进行Box-Benhnken设计实验，以选择最佳提取工艺条件并进行验证实验。

2.1 确定双水相体系

2.1.1 C2H5OH质量分数对双水相体系的影响

在双水相体系中，（NH4）2SO4质量分数为22%，改变C2H5OH的质量分数，在室温条件下静置使其分相，对上下相溶液进行测定，结果如图1。

由图1可知，当C2H5OH质量分数为27%时，沙米黄酮提取率最大83.2%。当C2H5OH质量分数超过27%时，两相体系出现（NH4）2SO4不能完全溶解的现象。说明最佳C2H5OH质量分数为27%。

2.1.2 (NH4)2SO4质量分数对双水相体系的影响

在双水相体系中，取C2H5OH的质量分数27%，改变（NH4）2SO4的质量分数，室温条件下静置使其分相，对上下相溶液进行测定，结果如图2。

由图2可知，在（NH4）2SO4质量分数小于14%时溶剂体系不成相，这主要是因为（NH4）2SO4质量分数很低时盐析效果不明显。当（NH4）2SO4质量分数为16%时，沙米黄酮的萃取率最大87.2%，而随着（NH4）2SO4质量分数的增加，其萃取率逐渐减少，原因当（NH4）2SO4的质量分数过高时，盐析作用过强，另外（NH4）2SO4质量分数增加，乙醇相体积会减少，相比降低，黄酮将被部分析出［5］。故22%-24%（NH4）2SO4时有部分不溶解沉淀沉在底层。因此（NH4）2SO4的最佳质量分数为16%。

2.2 单因素的确定

2.2.1 粗提液质量分数对萃取效果的影响

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4双水相体系中，改变粗提液质量分数。室温条件下静置使其分相，对上下相溶液进行测定，结果如图3。由图3可知，粗提液质量分数为12%时，其沙米总黄酮萃取率达85.6%。随着粗提液质量分数持续增加，粗提液体积大，粗提液在浓缩时体积的增大，浓缩时间变长而部分被氧化，使沙米总黄酮萃取率逐渐减小。而粗提液质量分数太小，提取不完全［6］。因此最佳粗提液质量分数为12%。

图1 C2H5OH质量分数对双水相体系的影响

图2 (NH4)2SO4质量分数对双水相体系的影响

2.2.2 NaCl质量分数对萃取效果的影响

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4双水相体系中，12%粗提液下加入不同质量分数的NaCl，室温条件下静置使其分相，对上下相溶液进行测定，结果如图4。由图4可知，NaCl质量分数为1.5%时，其萃取率最大77%，原因是加入少量无机盐时，由于无机盐的正负离子在两相系统中分配不同，将在两相间产生电位差，两相间电位差的变化，缩短了分相时间，提高了相分离速度［7］，沙米黄酮在上相的分配增加，随着NaCl质量分数的继续加大，其萃取率减小，因为萃取相的极性增强，使沙米黄酮的溶解度下降，而出现盐析现象［7］。因此，最佳NaCl的质量分数选择1.5%。

2.2.3 pH值对沙米黄酮萃取效果的影响

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4双水相体系中，加入1.5%的NaCl后，再加入12%的粗提液，改变pH值。室温条件下静置使其分相，对上下相溶液进行测定，结果如图5。由图5可知，当pH值为7时，沙米黄酮萃取率达到最大；pH＞7时，随着pH值的增大萃取率减小，因pH＞7，使黄酮杂环链裂解，导致萃取率降低。因此最佳体系pH值选择中性。

图3 粗提液质量分数对萃取效果的影响

图4 NaCl质量分数对沙米黄酮萃取效果的影响

图5 pH值对沙米黄酮萃取效果的影响

由图5可知，在当pH＜7时，沙米黄酮萃取率随着pH值的增大而增大；当pH值为7时，沙米黄酮萃取率达到最大；当pH＞7时，随着pH值的增大萃取率减小，是因为当pH＞7时，使黄酮杂环链裂解，导致萃取率降低。因此选择pH7。

2.3 曲面响应法对提取沙米黄酮工艺的优化结果分析

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4双水相萃取体系中影响萃取率的3个因素（粗提液质量分数、NaCl质量分数、pH值）为考察对象，按表1进行3因素17水平优化实验，以提取率为指标，考察综合因素对提取率的影响，选择最佳沙米总黄酮提取工艺参数，实验水平见表1，结果见表2。

表1 响应面设计的因素与水平Table1 The factors and level of response surface design

表2 Box-Benhnken实验设计及响应值表(N=17)Table2 Box-Benhnken experimental design and response value (N=17)

2.3.1 Box-Benhnken实验数据分析

以萃取率为响应值，根据表2结果，用Design-Expert8.6.0软件进行多元回归分析，结果如表3。经回归拟合后得到的回归方程为：Y=52.44-0.525A+6.7625B+1.9375C+3.525AB+3.975AC-0.6BC+1.105A2+20.48B2+5.73C2（A、B、C分别代表粗提液、pH、NaCl的编码值）。

表3 响应面方差分析Table3 response surface analysis of variance

由表3可知，模型Pr＞F值小于0.0500，说明该模型是极显著的；B、B2影响极显著，C2影响显著，其余项影响不显著［11］。模型失拟项＞F值为0.606，说明回归方程具有很好的拟合度。同时，模型的相关系数R2=0.949256，表明94.9256%的实验数据的变异性可用此回归模型来解释［8］。变异系数（C.V）反映模型的置信度，C.V值越低模型的置信度越高，本实验的C.V值为6.69445%，说明模型方程可以很好地反映真实的实验值，因此，我们可以用该模型来分析响应值的变化［9］。

2.3.2 响应面交互作用分析与优化

为了进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点，通过Design-Expert8.6.0软件绘制响应面曲线图来进行分析，见图6。通过软件分析计算，得到沙米黄酮萃取率最大时的工艺条件为：A=0.94，B=0.96，C=1.00，即粗提液质量分数为13.88%，pH值为8，NaCl质量分数为2%，此时萃取率预测值为92.5033%。在此条件下进行验证实验，结果沙米黄酮的萃取率为91.29%，与理论值基本吻合，表明该模型合理有效。

图6 粗提液质量分数、pH值、NaCl质量分数对萃取率交互作用的等高线图Fig.6 crude extract concentration, pH value, NaCl concentration on the extraction rate of the interaction of contour maps

3、讨论

双水相萃取与传统方法相比，具有如下优点：不存在有机溶剂残留、分相时间短、萃取周期短易于生产、能除去大量杂质和固体物质、易于工程放大和连续操作等，被广泛应用于生物化工、天然活性产物等领域［10］。国内外有将该体系用于天然活性成分的研究，但侧重于如何提高目标产物萃取率，忽略了目标成分与杂质的分离问题，若经离心分相，方能得到界面清晰的双水相体系，从而萃取过程中不易发生乳化，能更好地除去不溶性杂质。针对这一情况，本实验运用C2H5OH/（NH4）2SO4体系，在保证分离效果的前提下，系统地考察了该体系对沙米黄酮的萃取条件，而且使沙米中黄酮与样品溶液中其他物质得到有效分离。本研究为黄酮的萃取分离提供了一种有效方法，旨在为沙米黄酮的分离纯化和开发利用提供一定的依据。

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Optimization of extraction technology of total fl avonoids from Agtiopllyllum squarrosum using response surface analysis

ZHANG Zhong-hua1YANG Ai-mei2
The phamaceutical department of Gansu provincial hospital of Traditional Chinese Medicine， College of Life Science and Engineering， Lanzhou University of Technology Lanzhou，730050，Gansu，China；

Abstrect:Objective: Optimization of extraction technology of total flavonoids from Agtiopllyllum squarrosum using response surface analysis.Method:An aqueous two-phase system composed of 27%C2H5OH and 16%Na2SO4 was used to extract total flavonoids from Agtiopllyllum squarrosum.The effects of crude extract mass fraction， NaCl mass fraction and pH value on the extraction efficiency of total flavonoids were explored by one-factor-at-a-time and Box-Benhnken design methods.Result:The optimal aqueous two-phase extraction conditions were crude extract mass fraction of 13.88%， NaCl mass fraction of 2% and pH of 8and extraction rate of 91.29%.Conclusion: Under this condition， the experiment is carried out， and the conclusion is basically in agreement with the theoretical value， which indicates that the model is reasonable and effective..

Response surface method； Aqueous two-phase system； Agtiopllyllum squarrosum； Flavonoids

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