miR-203及其下游靶基因p63、生存素在银屑病皮损中的表达

许功军 蔡绥勍

·论著·

miR-203及其下游靶基因p63、生存素在银屑病皮损中的表达

许功军 蔡绥勍

目的 检测寻常性银屑病皮损中miR-203及其下游靶基因p63、生存素的表达水平。方法 实时PCR法检测30例寻常性银屑病患者皮损及30例健康对照皮肤中miR-203、p63、生存素mRNA的表达水平，miR-203以U6为内参照，p63和生存素以GAPDH为内参照；Western印迹法检测靶基因p63、生存素蛋白表达水平，两组间比较采用t检验，寻常性银屑病皮损中miR-203与生存素、p63表达的相关性采用Pearson相关分析。结果 与健康对照皮肤相比，寻常性银屑病皮损中miR-203 mRNA表达量为对照组的（0.41±0.11）倍，表达明显下调（t=3.16，P＜0.05）；其靶基因 p63、生存素 mRNA表达量分别为对照组的（4.79±0.63）和（3.43±0.46）倍，表达水平明显上调（t值分别为4.72、4.35，均P＜0.05）；靶基因p63、生存素蛋白表达量分别为对照组的（2.40±0.23），（3.49± 0.14）倍，表达水平也明显上调（t值分别为 3.87、4.36，均 P ＜0.05）。寻常性银屑病皮损中miR-203 mRNA 与生存素 mRNA 呈负相关（r=-0.36，P＜0.05），与 p63 mRNA 呈负相关（r=-0.43，P＜0.05）。结论 miR-203及其下游靶基因p63、生存素可能参与了银屑病的发病过程。

银屑病；miR-203；基因，p63；生存素

银屑病的确切病因尚未明确，以往的研究证实，凋亡抑制基因生存素和p63在寻常性银屑病皮损中高表达［1-2］，且参与角质形成细胞异常增殖等病理过程，但其具体的调控机制不清。miRNA广泛存在于哺乳动物基因组中，具有高度的保守性，在肿瘤、炎症等疾病的发生发展中起着关键的调控作用［3］。根据5′端序列不同，miRNA可分为多个家族，无法划分为一个家族的称为孤儿miRNA，其中miR-203位于14q32.33，在上皮组织特异性表达，参与皮肤发育、稳态及功能维持，是皮肤中重要的调控因子［4］。此外，miR-203在上皮组织肿瘤中有抑癌和促凋亡作用，参与上皮来源肿瘤的发生［5］。miR-203为生存素和p63上游重要的调控基因［6-7］。本研究检测寻常性银屑病皮损组织中miR-203、生存素和p63 mRNA及蛋白的表达水平，探讨寻常性银屑病皮损中p63和生存素基因表达上调的原因。

材料和方法

一、临床资料

收集2013年1-12月我科病理室保存的30例寻常性银屑病患者皮损蜡块标本。其中男15例，女15例，年龄17～56岁，平均年龄30.1岁。部位包括四肢19例，头面部1例，胸背部10例。另选取30例健康人皮肤为对照组，两组在年龄、性别、取材部位上相匹配。本研究获医院伦理委员会批准，所有银屑病患者与健康人对照组均签署知情同意书。

二、材料与试剂

石蜡组织miRNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术公司），一步法反转录试剂盒、SYBR Green I实时定量PCR试剂盒（美国罗氏公司），引物（上海吉玛生物技术公司），DEPC及RNA-free水（北京索莱宝生物技术公司），氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为分析纯（国药集团上海试剂公司），鼠抗人p63、生存素、β肌动蛋白多克隆抗体（英国Abcam公司）；HRP标记的山羊抗鼠二抗（中杉金桥公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL显色试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）。

三、实验方法

1.总RNA和miRNA提取：去除标本周围尽量多的石蜡，10 μm连续切片，取4张切片装入1个无RNase的Ep管中，二甲苯脱蜡，无水乙醇洗涤并晾干，后续提取步骤严格按照试剂盒说明书进行。应用微量紫外分光光度计测定总RNA的纯度和浓度。

2.实时荧光定量RT-PCR检测miR-203、生存素及p63 mRNA的表达：采用一步法反转录试剂盒合成cDNA，采用20 μl反应体系，具体参见试剂盒说明书，miRNA的反转录采用加尾。SYBR green I染料法进行实时荧光定量RT-PCR反应，取1 μl上述cDNA为模板，miR-203以U6作为内参照，生存素和p63以GAPDH作为内参照。每个检测样本做3个复孔，反应条件为：95℃预热 3 min；95℃ 12 s，60℃40 s，40个循环。ΔCt值=目的基因Ct值-同组内参Ct值，ΔΔCt=ΔCt实验-ΔCt对照。以对照组目的基因表达量为1，2-ΔΔCt值即为实验组目的基因较对照组目的基因表达的倍数。

3.Western印迹法检测生存素及p63蛋白的表达水平：同一批健康对照组新鲜皮肤组织和银屑病患者新鲜皮损组织中加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，经玻璃匀浆器匀浆直至充分裂解。14 000×g离心5 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。以30 μg上样量经SDS-PAGE胶电泳（浓缩胶80 V、分离胶120 V），以200 mA恒流1.5 h湿转到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，鼠抗人p63、生存素、β肌动蛋白多克隆抗体4℃孵育过夜（工作浓度1∶1 000），TBST洗膜 3次，每次 10 min。加入 HRP标记的二抗（1∶5 000）孵育 1 h，TBST洗膜 3次，每次10 min，ECL法显色。Image J分析软件分析目的蛋白条带的平均灰度值，以β肌动蛋白作为内参，以目的蛋白与β肌动蛋白的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量，进行统计学分析。

四、统计学处理

采用SPSS17.0统计软件，miR-203、生存素、p63的表达水平以±s表示，两组之间的差异比较采用t检验，应用Pearson相关性分析，分析miR-203 miRNA表达与生存素miRNA、p63 miRNA表达之间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、miR-203、生存素、p63 mRNA在寻常性银屑病皮损中的表达水平

银屑病皮损中miR-203 mRNA表达量为对照组的0.41±0.11倍，两组间差异有统计学意义（t=3.16，P＜0.05）。生存素和p63 mRNA在银屑病皮损中的表达量分别为对照组的3.43±0.46和4.79±0.63倍，两组间差异均有统计学意义（t值分别为 4.35、4.72，均 P＜0.05）。经 Pearson相关性分析，miR-203 mRNA与生存素mRNA呈负相关（r=-0.36，P＜0.05），与 p63 mRNA 呈负相关（r=-0.43，P ＜ 0.05）。

二、靶基因生存素、p63蛋白在寻常性银屑病皮损中的表达水平

生存素和p63蛋白在银屑病皮损中的表达量分别为对照组的3.49±0.14和2.40±0.23倍，经t检验，两组差异有统计学意义（t值分别为4.36、3.87，均 P ＜ 0.05）。见图 1。

讨 论

miRNA是内源性非蛋白编码单链小分子RNA，主要功能为转录后水平抑制靶基因的表达，参与基因表达的调控过程，从而在细胞分化、增殖、凋亡、抗病毒及肿瘤免疫中发挥作用［3］，miRNA对其靶基因的调节障碍会导致不同疾病的发生［8］。miR-203是一种具有高度皮肤特异性的miRNA，明显表达于表皮基底层，通过抑制增殖潜能、诱导细胞周期退出，促进表皮的分化［4-5］，其低表达于银屑病皮损中，这与本研究的结果一致。

图1 Western印迹法检测寻常性银屑病皮损与健康对照组皮肤组织中生存素以及p63蛋白的相对表达量 上图为Western印迹结果，下图为相对灰度值的柱状图。与对照组相比，寻常性银屑病皮损中生存素和p63表达显著上调（P＜0.05）

生存素和p63都是miR-203进化保守的靶基因。生存素主要在细胞周期G2/M期表达，定位于细胞有丝分裂的纺锤体，具有促进细胞有丝分裂的作用［9］。此外，生存素还可以直接抑制各种凋亡途径的终末效应蛋白Caspase-3和Caspase-7，发挥抑制细胞凋亡的作用［10］。本研究结果发现，寻常性银屑病皮损中生存素mRNA的表达水平较健康对照皮肤组织明显上调，这与国内外的研究结果均一致［11-14］。生存素的高表达与银屑病角质形成细胞的异常增殖和分化有关，同时参与了真皮乳头层毛细血管的增生、扩张［15］。p63基因是肿瘤抑制基因p53家族成员之一，其在细胞死亡、分化、肿瘤发生中扮演重要角色，在维持表皮干细胞和表皮的分层中发挥较大作用［16］，控制着角质形成细胞的增殖和分化。本研究结果发现，p63在银屑病皮损中表达上调，这与国外的研究结果一致［17-18］，有研究表明，p63基因可能参与银屑病的早期阶段，并与表皮突的延伸相关。经统计分析，miR-203 mRNA的表达水平与生存素mRNA的表达水平呈负相关，与p63 mRNA的表达水平呈负相关，由此推测，miR-203的异常表达可能导致生存素和p63基因表达上调，进而促进角质形成细胞增殖，抑制其凋亡，参与皮损的形成过程。

综上所述，miR-203可能通过调控其下游靶基因生存素、p63的异常表达参与寻常性银屑病皮损的形成过程。

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Expressions of miR-203 and its downstream target genes p63 and survivin in psoriatic lesions

Xu Gongjun,Cai Suiqing*.*Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310009,China

Cai Suiqing,Email:caisuiqing@163.com

ObjectiveTo measure the expressions of miR-203 and its downstream target genes p63 and survivin in psoriasis vulgaris lesions.MethodsTissue specimens were collected from lesions of 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 30 healthy human controls.Real-time PCR was performed to detect miR-203 mRNA expression with U6 as the internal control,as well as p63 and survivin mRNA expressions with glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）as the internal control,and Western blot to measure the protein expressions of miR-203 targets p63 and survivin.Statistical analysis was carried out byttest for intergroup comparisons and by Pearson correlation analysis for the analysis of correlation between miR-203,p63 and survivin expressions in psoriasis vulgaris lesions.ResultsCompared with the normal control skin,psoriasis vulgaris lesions showed significantly decreased mRNA expression level（2-△△C）tof miR-203（0.41±0.11,t=3.16,P＜0.05）,but increased mRNA expression levels of p63（4.79±0.63,t=4.72,P＜0.05）and survivin（3.43±0.46,t=4.35,P＜0.05）.The protein expression levels of p63 and survivin in these lesions were（2.40 ± 0.23）times（t=3.87,P ＜ 0.05）and（3.49 ± 0.14）times（t=4.36,P ＜ 0.05）those in the normal control skin respectively.In psoriasis vulgaris lesions,the mRNA expression level of miR-203 showed a significantly negative correlation with that of survivin （r=-0.36,P＜0.05）and p63 （r=-0.43,P＜0.05）.ConclusionmiR-203 and its downstream target genes p63 and survivin may participate in the occurrence of psoriasis vulgaris.

Psoriasis;MiR-203;Genes,p63;Survivin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.005

310009杭州，浙江大学医学院附属第二医院皮肤科［许功军（现在浙江省金华市第五医院，321000）、蔡绥勍］

蔡绥勍，Email：caisuiqing@163.com

2015-01-28）

（本文编辑：颜艳）