温度对固态制曲-水解制备抗氧化大豆肽的影响研究

王海萍，崔　春，钱杨鹏，赵海峰（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

温度对固态制曲-水解制备抗氧化大豆肽的影响研究

王海萍，崔春*，钱杨鹏，赵海峰
（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

以豆粕为原料，通过固态制曲-液态水解制备大豆肽，探究水解温度对大豆肽水解液水解效率、抗氧化性、滋味特性的影响。研究表明，随着温度的升高，水解效率逐渐降低，均质处理相比于未均质处理具有较好的水解效果，45℃均质处理水解效果最好，总氮1.08%，氨基酸态氮0.55%，水解度50.64%，蛋白回收率64.25%。45℃未均质处理大曲水解液DPPH清除率、还原力均最高，分别是谷胱甘肽的85.8%和1.71倍；50℃均质处理水解液ABTS清除率最高，是谷胱甘肽的1.22倍。此外，对抗氧化性较好的大豆肽水解液进行鲜味、厚味、后味评定，45℃未均质处理组各项指标均较好，50℃均质处理组鲜味得分最高，为6分。

豆粕，固态制曲，水解，抗氧化性，滋味

近年来，肽类物质尤其是大豆肽因其特殊的营养价值和功能特性成为国内外学者研究的热点。大豆肽是以大豆、豆粕或大豆蛋白为主要原料，用酶解法或微生物发酵法生产的，经过分离精制等处理而得到的低聚肽混合物［1］。与大豆蛋白相比，大豆肽具有分子量小、溶解性好、粘度低、吸水性保水性强等优势。除此之外，大豆肽还具有抗氧化、抗疲劳、降血压和降血脂等多种生理功能，是一种多用途的功能性食品配料和肽类药物原料［2］。研究表明大豆肽的抗氧化活性与其降血压、降低胆固醇、抗癌等功能存在一定相关性［3］，因此可将其抗氧化性的研究作为其他功能特性研究的基础。

目前，豆粕水解制备大豆肽的研究越来越多，大多是采用条件温和的酶解进行，但由于蛋白酶价格昂贵、产物得率不高且带有较明显的苦味限制了其在食品行业的广泛应用。而发酵法将蛋白酶生产和大豆肽的酶解生产有机结合，降低了生产成本，具有较好的应用前景［4］。目前发酵豆粕制备大豆肽的研究主要集中在发酵特性的探究、发酵条件的优化以及发酵产物功能特性研究等方面。王俊［5］以米曲霉发酵豆粕大曲为原料进行酶解，探讨大曲酶解特性；姜曼等［6］采用黑曲霉、米曲霉单菌株及混合发酵，探究固态发酵豆粕制备大豆肽的最优条件；Hong等［7］采用米曲霉发酵豆粕，显著降低了大分子抗原蛋白含量。

本研究通过米曲霉固态制曲，探究温度对水解制备大豆肽抗氧化性及产物滋味的影响，为开发高品质大豆肽提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

高温豆粕、面粉均为市售；曲精（沪酿3.042）购于广东省微生物研究所；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐）、L-谷胱甘肽（还原型） 均为Sigma公司提供；无水乙醇、三氯乙酸、铁氰化钾、氯化铁、浓硫酸、氢氧化钠等均为分析纯。

THZ-82AX型恒温水浴振荡器常州澳华仪器有限公司；GL-21M型高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；KDN-103F型凯氏定氮仪上海纤检仪器有限公司；UV1810紫外分光光度计北京普析通用仪器设备有限责任公司；ZJP-A1230霉菌培养箱上海智城分析仪器制造有限公司；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；TM840自动电位滴定仪上海摩达科学器材公司；数显分散高速均质机上海标本模型厂。

1.2实验方法

1.2.1固态制曲工艺豆粕使用高压蒸汽灭菌锅先干蒸20 min（121℃），后添加80%水（以豆粕干重计）润湿，湿蒸18 min（125℃）。出锅冷却至40℃，拌入面粉和曲精的混合物（以豆粕干重计，面粉添加量为0.2%，曲精为0.04%）。培养箱30℃培养36 h即可出曲。期间定时进行翻曲、调湿，控制品温不超过38℃。

1.2.2液态水解工艺将制备的大曲粉碎、混匀，按料液比1∶4加入去离子水，分为均质组和未均质组，均质组利用数显分散高速均质机均质2 min（8000 r/min），然后在45、50、55、60℃恒温振荡器中水解24 h后沸水浴灭酶15 min，冷却后离心20 min（8000 r/min），取上清液即为大豆肽酶解液。

1.2.3基本指标的测定总氮的测定：凯氏定氮法，参考GB 5009.5-2010食品中蛋白质的测定。

氨基酸态氮的测定：甲醛滴定法，参考GB/T 5009.39-2003酱油卫生标准的分析方法。

1.2.4多肽分子量分布采用凝胶色谱法［5］，检测条件：Waters高效液相色谱（Waters 600），TSKgelG2000SWXL分析柱；洗脱液为磷酸缓冲液（38 g Na2HPO4·12H2O+ 5.04 g NaH2PO4·2H2O+1 mL三氟乙酸+超纯水定容到1 L），流速1 mL/min，样品浓度为1 mg/mL，进样体积20 μL，检测波长214 nm。标准肽样品：Conalbumin（75000u），Oralbumin（43000u），Cytochromec（12384u），Aprotinin（6512 u），Vitamin B12（1855 u），Glutathione（307 u），相对分子质量的对数值与洗脱体积拟合直线方程为y=-0.1547x+5.6431（R2=0.9957），其中，y为标准肽分子量的对数；x为洗脱体积。

1.2.5DPPH自由基清除率测定方法参照Sun等的方法［8］，用去离子水将大曲酶解液稀释到蛋白浓度1 mg/mL。取2 mL稀释液与2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L）混合均匀后避光放置30 min，517 nm测其吸光值，计为Ai；相同方式测定2 mL蒸馏水和2 mL DPPH混合均匀避光放置30 min，517 nm吸光值，计为Ac；测定2 mL稀释液加2 mL无水乙醇混合均匀后517 nm吸光值，计为Aj。用2 mL水加2 mL乙醇混合均匀调零。以0.05 mg/mL谷胱甘肽溶液作为阳性对照。

1.2.6还原力测定方法参照任娇艳的方法［9］，用去离子水将大曲酶解液稀释到蛋白浓度1 mg/mL。取1 mL样品于试管中，加入1 mL 0.2 mol/L pH6.6磷酸盐（PBS）缓冲溶液，混合均匀后，加入1 mL 1%铁氰化钾溶液，50℃恒温水浴锅保温20 min后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀，3000 r/min离心10 min，取上清液2 mL于试管中，分别加入2 mL去离子水，0.4 mL 0.1%的氯化铁溶液，反应10 min后测定波长700 nm处吸光值记为样品的还原力。以0.05 mg/mL谷胱甘肽（GSH）溶液作为阳性对照。

1.2.7ABTS自由基清除能力的测定参照游丽君的方法［10］，ABTS自由基储备液的制备：以去离子水将ABTS和过硫酸钾K2S2O8分别溶解并混合，使其终浓度分别为14 mmol/L和4.9 mmol/L，在室温避光条件下静置12～16 h。测定时将ABTS储备液以50%乙醇溶液稀释，使其在734 nm时吸光度达0.7±0.02，形成ABTS自由基测定液。取2.9 mL ABTS自由基测定液，加入0.1 mL样品稀释液，准确振荡30 s，测定反应20 min后在734 nm处吸光值Ai。用50%乙醇溶液代替样品稀释液，按照同样的步骤测定样品空白值A0。以0.05 mg/mL谷胱甘肽溶液作为阳性对照。

1.2.8感官评定参考Masashi Ogasawara［11］的感官评定方法对不同水解温度大曲水解液进行感官评定，用去离子水将水解液稀释到1%蛋白浓度，并添加1.5%味精，0.5%NaCl作为感官评定样品。采用7分制，以添加1%麦芽糊精、1.5%味精、0.5%NaCl溶液作为标准溶液。标准溶液各项目评分为3分。

1.2.9数据分析文中实验均重复3次，采用Microsoft Excel 2007对数据进行统计分析。

2　结果与讨论

2.1不同水解温度大曲水解特性

2.1.1不同水解温度对大曲水解效率的影响图1和图2分别表示不同温度、不同处理条件下大曲水解液氨基酸态氮、总氮含量变化以及水解度、蛋白回收率的变化。

图1　水解温度对大曲水解液氨基酸态氮、总氮含量的影响Fig.1　Effect of hydrolysis temperature on total nitrogen，ammonia nitrogen content of koji hydrolyzates

图2　水解温度对大曲水解液水解度、蛋白回收率的影响Fig.2　Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis，protein recovery of koji hydrolyzates

由图1、图2可知，随着温度的升高大曲水解液的氨基酸态氮、总氮、水解度、蛋白回收率逐渐下降，45℃时各指标均最大，表明45℃是大曲酶系协同作用的最适温度。马俊阳［12］研究发现从米曲霉中获取的两种蛋白酶均在低于40℃的条件下有很好的稳定性，50℃时会缓慢失活，而一旦超过60℃则极不稳定，同时综合温度对两种蛋白酶的活性和稳定性的影响来看，两种中性蛋白酶的最适使用温度为45℃，且不宜超过50℃，这与本研究结果一致。Takeharu Nakahara等［13］探究了15、30、45℃酱醪中亮氨酸氨肽酶Ⅰ、Ⅱ和丝氨酰（基）-酪氨酸的水解活性，发现随着温度的升高，其水解活性逐渐降低。Su等［14］报道酱油曲的粗酶提取液经过45℃处理240 min，蛋白水解酶活性达70%，55℃处理240 min，活性下降至17%。因此预测造成大曲水解液氨基酸态氮、总氮、水解度、蛋白回收率随水解温度升高而降低的主要原因是高温使得大曲中部分蛋白酶失活。此外，均质处理组大曲水解效果好于未均质组。这可能是因为均质处理后原料及米曲霉细胞破碎，更易于酶从米曲霉细胞中分泌出来，增大与底物的接触面积，利于水解的进行。

2.1.2不同水解温度对大曲水解液肽分子量分布的影响表1为不同水解温度不同处理条件下大曲水解液肽分子量分布结果，大曲水溶液经过8000 r/min 2 min均质处理或不做均质处理之后，随着水解温度的升高，＞10000 u、5000～10000 u大分子肽段呈上升趋势，1000～3000 u、＜1000 u小分子肽段呈下降趋势，尤其是＜1000 u的小肽受温度和均质处理影响较为明显，均质处理组小分子肽比例稍高于未均质处理组。45℃均质处理组分子量＜1000 u的肽段占43.16%，而60℃相同处理分子量＜1000 u的肽段占23.50%，说明低温利于大曲酶系活性的保留，而均质处理后细胞破碎，酶系更易作用于蛋白质和大分子肽，利于小分子肽的积累。就富集分子量＜3000 u肽段而言，45、50、55、60℃未均质处理组其肽段分别占67.17%、63.18%、50.44%、41.28%，而均质处理后其比例均有不同程度的增加，分别为69.12%、64.03%、60.4%、47.71%。

表1　不同水解温度对大曲水解液多肽分子量分布的影响（%）Table 1　Effect of hydrolysis temperature on peptide molecular weight distribution of koji hydrolyzates（%）

2.2不同水解温度对大曲水解液抗氧化性的影响

2.2.1不同水解温度对大曲水解液DPPH自由基清除率的影响以0.05 mg/mL谷胱甘肽为对照，测定了不同水解温度对大曲酶解液DPPH清除率的影响，结果如图3所示。谷胱甘肽的DPPH清除率达68.8%，随着水解温度的升高，大曲水解液清除率呈下降趋势，50、55、60℃条件下，均质处理组水解液清除率均高于未均质处理组水解液。45℃未均质处理组大曲水解液DPPH清除率最高达59.03%，是谷胱甘肽的85.8%。研究表明，多肽的抗氧化性与其分子量密切相关，Chen等［15］认为相对分子质量分布在600～1700之间的多肽具有高抗氧化能力。水解温度和处理方式不同，会使得大曲酶对底物切割程度不同，会使得产物肽分子量有所区别，较低温度下大曲酶系活性保留，易于蛋白质、多肽降解为小分子肽。而45℃未均质组清除率高于均质组，可能是因为均质条件下，水解效果优于未均质，造成抗氧化肽的降解，产生较多分子量低而不具备抗氧化性的小分子肽。

图3　水解温度对大曲酶解液DPPH清除率的影响Fig.3　Effect of hydrolysis temperature on the DPPH scavenging of koji hydrolyzates

2.2.2不同水解温度对大曲水解液还原力的影响以0.05 mg/mL谷胱甘肽为对照，测定了不同水解温度对大曲酶解液还原力的影响，吸光值越大说明样品还原力越高，结果如图4所示。45℃未均质处理组大曲水解液还原力最高，是谷胱甘肽的1.71倍。

图4　水解温度对大曲酶解液还原力的影响Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on the reducing capability of koji hydrolyzates

图5　水解温度对大曲酶解液ABTS清除率的影响Fig.5　Effect of hydrolysis temperature on the ABTS scavenging of koji hydrolyzates

2.2.3不同水解温度对大曲水解液ABTS自由基清除率的影响图5显示了不同水解温度下大曲水解液的ABTS清除率，表明50℃均质处理组水解液清除率最高达59.5%，是谷胱甘肽的1.22倍。这与DPPH清除率、还原力等指标得出的结论具有一定差异，这可能是不同指标测定原理不一，所作用的抗氧化物质之间的差异造成的。综合水解温度对DPPH清除率、还原力的影响发现，较低水解温度下水解液具有较高的抗氧化性，这与大曲中酶系的协同作用密切相关，高温使得部分蛋白酶部分失活。

2.3抗氧化大豆肽水解液滋味特性

在大曲水解过程中，呈味能力较弱的大分子蛋白质经过水解后生成易与味蕾接触产生具有呈味作用的小分子肽与游离氨基酸，同时水解过程中多肽与水解液中糖类等发生美拉德反应，从而形成具有一定鲜味、醇厚味和后味的水解液。不同水解条件下产生的肽的分子量、总类、数量等不同，因此其水解物的滋味特性具有一定差异。由抗氧化实验可知，45℃未均质组、50℃均质组以及55℃均质组得到的大豆肽水解液抗氧化性较好，表2反映了抗氧化性较好的大豆肽水解液滋味特性的得分，45℃未均质组各项指标均较好，50℃均质组鲜味得分最高为6分，该结果表明较低温度下水解液具有较好的滋味特性。

表2　抗氧化大豆肽水解液滋味特性Table 2　Flavor characteristics of antioxidant soybean peptides

3　结论

水解温度对大曲酶解制备大豆肽水解液水解效率、抗氧化性、滋味特性具有重要的影响。随着水解温度的提高，大曲水解效率逐渐降低，均质处理相比于未均质处理具有较好的水解效果，45℃均质处理水解效果最好，水解液各指标为：总氮1.08%，氨基酸态氮0.55%，水解度50.64%，蛋白回收率64.25%。

45℃未均质处理大曲水解液DPPH清除率、还原力均最高，DPPH清除率达59.03%，是谷胱甘肽的85.8%，还原力是谷胱甘肽的1.71倍；50℃均质处理水解液ABTS清除率最高，达59.5%，是谷胱甘肽的1.22倍。不同水解温度大曲水解液抗氧化性不同，这与大曲产生的多肽种类、数量密切相关。此外，对抗氧化性较好的大豆肽水解液进行滋味评定，45℃未均质处理时各项指标均较好，50℃均质处理鲜味得分最高为6分。综合以上结果可知，45℃未均质处理水解制备的大豆肽水解效率、抗氧化性、滋味特性均较好。

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Study on effect of temperature on soybean antioxidative peptides prepared by solid-state fermentation and hydrolysis

WANG Hai-ping，CUI Chun*，QIAN Yang-peng，ZHAO Hai-feng
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The objective of this study was to evaluate the effect of temperature on the efficiency of hydrolysis，antioxidant activity and flavor characteristics of soybean peptides prepared by soybean meal solid-state fermentation and hydrolysis.Results showed that，with the increasing temperature，hydrolysis efficiency gradually decreased.Koji treated by homogeneous process had better hydrolysis efficiency.Homogeneous process at 45℃resulted in the maximum hydrolysis efficiency.Under this conditions the total nitrogen，ammonia nitrogen，DH，protein recovery of hydrolyzates were 1.08%，0.55%，50.64%，64.25%，respectively.The highest DPPH radical scavenging activity and reducing capability of koji hydrolysate were observed at 45℃ without homogeneous process，which were 85.8%and 1.71 times of those of GSH.The highest ABTS radical scavenging activity was achieved at 50℃ with homogeneous process，which was 1.22 times of that of GSH. Sensory evaluation of hydrolysates with higher antioxidant activity in umami，savory and aftertaste showed that hydrolysate at 45℃ without homogeneous process had a better score in three aspects and that at 50℃ with homogeneous process had the highest umami score，6 points.

soybean meal；solid-state fermentation；hydrolysis；antioxidant activity；flavor characteristics

TS214.2

A

1002-0306（2015）20-0225-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.039

2015－01－06

王海萍（1990-），女，硕士，研究方向：食品生物技术，E-mail：haipingaou@163.com。

崔春（1978-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：55354860@qq.com。

国家高技术研究发展计划（863计划）子课题（2012AA021302）；中央高校基本科研业务费专项（2014ZZ0053）。