一株产香真菌的初步鉴定及其挥发性成分分析

杨建远，杨云仙，汪香琴，李汉全，张炳火，*（.九江学院药学与生命科学学院，江西九江33000；.九江学院旅游与国土资源学院，江西九江33005）

一株产香真菌的初步鉴定及其挥发性成分分析

杨建远1，杨云仙2，汪香琴1，李汉全1，张炳火1，*
（1.九江学院药学与生命科学学院，江西九江332000；2.九江学院旅游与国土资源学院，江西九江332005）

为筛选产香菌株，本研究对真菌F036进行了形态学和ITS序列分析，初步确定其分类学地位。采用同时蒸馏萃取装置（SDE）提取其培养液中的香气物质，并利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析香气物质的组成。结果表明，菌株F036在PDA培养基上菌丝发达，有隔，呈乳白色，长时间培养后未产生孢子，最适温度为34～36℃，最适pH为5～6，具有产纤维素酶及木质素酶活性。该菌ITS序列与白耙齿菌（Irpex lacteus）的亲缘关系最近（99%），它们在系统进化树上聚在一支。在PDA培养基中，35℃、180 r/min的条件下培养3 d后，加入5%（V/V）的无水乙醇，再培养4 d，菌株F036产生了大量的香气物质。GC-MS分析表明，这些挥发性香气物质主要为反-桂酸甲酯（19.93%）、桂酸乙酯（19.66%）、苯甲醛（7.35%）、3-甲基丁醇（3.85%）、苯甲酸乙酯（2.82%）和芳樟醇（1.24%）等。因此，本研究筛选到的产香真菌F036能够产生许多挥发性香气物质，在天然香料开发方面具有较好的潜在价值。

真菌，ITS序列，挥发性物质，气相色谱-质谱联用

香精、香料的生产在食品、饲料、化妆品、化工和制药工业具有重要的地位［1］。天然香精、香料的生产方法主要有从植物材料中提取、植物细胞培养、酶法合成以及微生物发酵等［2］。其中，因微生物能有效利用天然原料大量催化合成天然香料产物，因此，微生物发酵法是目前最具吸引力的生产方法之一［3］。利用微生物发酵生产天然香精、香料的关键在于获得生产性能好的菌株。近年来研究表明，能合成或转化生产天然香气物质的微生物大多为真菌。例如，利用汉氏德巴利氏酵母发酵香肠产生醇、醛、酮、酸和酯类等香气化合物［4］；利用酿酒酵母高效连续催化L-苯丙氨酸合成天然苯乙醇［5］；利用担子菌类的薄皮干酪菌发酵苹果渣产生苯甲醛、α-金合欢烯、3-苯丙醛及苯甲醇等香气化合物［6］；利用内生真菌产乙醛、β-石竹烯及3-辛醇等［7］。微生物可通过直接生物合成和生物转化两种途径发酵合成各种天然香气成分，真菌是合成生产天然挥发性香气物质的重要资源之一。

本实验室筛选到一株丝状真菌F036，能在发酵过程中添加一定量乙醇的条件下产生浓郁的香味，本研究对真菌F036进行了初步鉴定，并对其挥发性成分进行了分析，为利用微生物发酵转化生产天然香精、香料提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

丝状真菌菌株F036为本实验室分离保存；PDA培养基；38#固体培养基4 g酵母膏，4 g葡萄糖，5 g麦芽膏，15～20 g琼脂，加水至1 L，pH 5.5～6.0；38#液体培养基4 g酵母膏，4 g葡萄糖，5 g麦芽膏，加水至1 L，pH5.5～6.0；Tris碱、十二烷基磺酸钠（SDS）、EDTA、RNase、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL 2000DNA marker、琼脂糖等均购于上海生工；二氯甲烷、醋酸钾、异丙醇、氯仿、异戊醇、无水硫酸钠和无水乙醇均为国产分析纯；引物ITS1：5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3’、ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3’ 由上海生工合成。

HP6890GC/5973MS气相色谱-质谱联用仪Agilent；TC-512PCR仪TECHNE；S23-2型恒温磁力搅拌器上海司乐仪器有限公司；SKY-2112C型恒温摇床上海实坤实业有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱上海恒科有限公司；同时蒸馏萃取装置安徽东冠器械设备有限公司；显微镜Motic；LXJ-IIB型离心机上海安亭科学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1形态特征将菌株接种到PDA固体培养基上，置于30℃培养3～5 d，观察菌丝生长及颜色，用插片法观察菌丝形态特征，每2 d观察一次，连续观察20 d。

1.2.2生长代谢特性考察温度、pH对菌株生长的影响，农业废弃物上生长情况及产香特性。

1.2.2.1温度对菌株生长的影响将活化的菌种接种于PDA平板培养基，30℃培养3 d，用直径5mm灭菌打孔器制备菌塞，将菌塞接种于PDA平板培养基中，每项设3个重复，分别在（4、8、12、16、20、24、28、30、32、34、36、38、40、42、44、48、52℃）不同温度下恒温培养3 d，测量菌落大小。

1.2.2.2pH对菌株生长的影响将活化的菌种接种于PDA平板培养基，每项设3个重复，35℃培养3 d，用直径5 mm灭菌打孔器制备菌塞，将菌塞接种于不同pH（pH1～14）的PDA平板培养基中，在35℃下恒温培养3 d，测量菌落大小。

1.2.2.3利用农业废弃物将粉碎的干燥棉花杆、稻草秆、芝麻杆、玉米杆和甘蔗杆，分别装入250 mL三角瓶，每瓶装20 g，并加入30 mL水，121℃灭菌30 min，接入菌塞，35℃培养观察生长情况。

1.2.2.4发酵产香将菌种接种于38#液体培养基，35℃，发酵3 d时加入5%乙醇，继续发酵培养至第7 d，观察检测产香情况。

1.2.3产纤维素酶实验将菌株接种在刚果红纤维素固体培养基上，置28℃培养3 d，观察是否有透明圈产生。

1.2.4产木质素酶实验参考武善军等［8］方法，将菌株接种到PDA显色培养基平板上（含0.01%的愈创木酚），28℃培养4 d。若菌株具有产木质素降解酶能力，则因愈创木酚的氧化在含愈创木酚的PDA平板上显示出红色，菌株产木质素降解酶的能力越强，红色颜色越深、范围越大。

1.2.5rDNA ITS序列分析提取菌株基因组DNA，PCR扩增ITS基因片段送上海生工测序，序列进行比对分析构建系统发育树。

1.2.5.1DNA的提取参考袁洪水等方法略有修改［9］。即：取少量菌丝球洗涤2次，放入1.5 mL离心管中，加适量的石英砂和DNA提取液后，用灭菌的研磨棒研磨2 min，取500 μL上清液，后续操作不变。

1.2.5.2ITS区域的PCR扩增PCR扩增反应体系（25 μL）：2.5 μL 10×DNA PCR Buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L引物各1 μL，1 μL DNA Template，0.25 μL Taq DNA Polymerase，加无菌双蒸水至25 μL。ITS PCR反应程序［10］：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环，72℃延伸10 min。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5.3系统发育树分析ITS扩增产物送上海生工测序后，将ITS序列通过Blast与GenBank中的核酸序列进行比对分析，利用Clustalx 1.8及Mega 5.0软件构建系统发育树。

1.2.6香气物质的提取及成分分析将试管斜面菌种接种于PDA液体培养基，培养3 d，再加入5%（V/V）的无水乙醇于培养基中继续发酵培养至第7 d，过滤发酵液，以二氯甲烷为萃取溶剂，经同时蒸馏萃取装置萃取挥发性香气物质，萃取物中加入适量无水硫酸钠，4℃过夜，滤纸过滤，滤液用于GC-MS分析，采用面积归一化法进行定量。

2　结果与分析

2.1形态特征

该菌在PDA培养基上生长较快，菌丝发达，呈乳白色（图1），直径约3～6 μm，菌丝有隔（图2），在培养皿中培养未产生孢子。

2.2培养特征

在PDA固体平板培养基上，8～44℃范围内能够生长，其中最适温度为34～36℃，pH为3～13范围内均能生长，生长最适pH为5～6。在以棉花杆、稻草秆、芝麻杆、玉米杆和甘蔗杆粉的各种固体培养基上也生长良好。

图1　菌株F036平板菌落特征Fig.1　Characteristics of colony on plate of F036 strain

图2　菌株F036菌丝特征（400×）Fig.2　Characteristics of mycelium of F036 strain（400×）

利用38#液体培养基对该菌进行发酵7 d，能产生愉悦的香气，在培养3 d时加入5%乙醇的培养发酵7 d时香气更浓。

2.3产纤维素酶实验结果

菌株接种刚果红显色培养基平板上，28℃培养3 d，有较明显的透明圈（图3）。表明菌株具有纤维素酶活性。

图3　刚果红平板显色结果Fig.3　The coloring result of plate of CongoRed

2.4产木质素酶实验结果

菌株接种含愈创木酚的显色培养基平板上，28℃培养4 d，出现较大的深红色显色圈（图4）。表明菌株具有木质素酶活性。

图4　愈创木酚被氧化结果Fig.4　The oxidation result of guaiacol

2.5rDNA ITS序列分析

rDNA ITS基因（658 bp）（图5）及序列分析表明，菌株F036与白耙齿菌（Irpex lacteus）亲缘关系最近（99%），它们在系统发育树上聚在一支（图6）。

图5ITS区PCR扩增产物电泳图Fig.5　Electrophoresis of PCR product of ITS region

图6　基于rDNA ITS序列同源性构建的系统发育树Fig.6　Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequences homology

2.6香气成分分析

蒸馏液中挥发性成分经GC-MS分析表明（图7），该菌液体发酵产生了30多种日化和食用香料物质（表1），其中含量较高的主要有反-桂酸甲酯（19.93%）、桂酸乙酯（19.66%）、苯甲醛（7.35%）、3-甲基丁醇（3.85%）、芳樟醇（1.24%）、苯甲酸乙酯（2.82%）。此外该菌发酵物中还有两种未知的挥发性物质，含量分别为0.3%和0.45%，是否为新的香料物质有待于进一步研究。

图7　菌株F036发酵液挥发性成分GC-MS总离子图Fig.7　Total ion chromatogram of volatile aroma compounds from fementation liquor of F036 strain

表1　菌株F036发酵液挥发性成分表Table 1　Volatile flavor compositions of fementation liquor of F036 strain

3　讨论

白耙齿菌是我国具有很高医学价值的一种药用真菌，其多糖、蛋白质和腺苷等具有重要药理活性。白耙齿菌还能够产生木质素酶［8］、纤维素酶［11］、锰过氧化物酶［12］、聚鼠李糖半乳糖醛酸水解酶［13］及漆酶［14］等可降解性酶类，对纤维素类物质降解能力强，菌体生长速度较快。白耙齿菌菌株的功能特性差异较大，Buzina等［15］从免疫抑制患者的肺脓肿中分离到一株病原性白耙齿菌菌株，Kim等［16］研究表明白耙齿菌具有矿化2，4，6-三硝基甲苯作用。目前，国内外鲜见白耙齿菌菌株产生香味物质的文献报道。

GC-MS分析结果表明，该菌株在发酵过程中添加了5%的乙醇发酵后产生了多种食用及日化香料物质，但成分中未检测到乙醇成分，是发酵过程中添加到培养基中的乙醇被完全被代谢了，还是菌株培养过程中产生了酯酶由酯化反应转化乙醇合成了桂酸乙酯等酯类香气物质呢？相关工作还在进一步研究中。肉桂酸酯在食品工业上，是一类安全可靠的食用香料，也是一类广泛用于食品、日化、医药工业的重要有机化合物［17-18］，生产天然肉桂酸酯具有重要价值，能产肉桂酸酯类香气物质的真菌菌株鲜见报道，丝状真菌F036产天然香气物质的机理值得进一步研究。

4　结论

本研究分离纯化到的丝状真菌F036生长条件要求低，在各种农副产物中能生长，温度及pH适应范围广，在PDA培养基上生长较快，具有产纤维素酶及木质素酶活性。结合菌丝形态学、部分生理生化特性及ITS序列分析结果，丝状真菌F036与白耙齿菌亲缘关系最近（99%）。

在培养过程中加入5%（V/V）的无水乙醇的条件下，丝状真菌F036在发酵培养基中产生了大量的挥发性香气物质，其中反-桂酸甲酯、桂酸乙酯等在食品工业中具有重要应用价值，丝状真菌F036在微生物发酵法生产天然香精、香料的研究开发方面具有潜在价值。

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Preliminary identification of an aroma-producing fungus strain and analysis of volatile compounds

YANG Jian-yuan1，YANG Yun-xian2，WANG Xiang-qin1，LI Han-quan1，ZHANG Bing-huo1，*
（1.College of Pharmaceutical and Life Sciences，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China；2.China College of Tourism and Territorial Resources，Jiujiang University，Jiujiang 332005，China）

In order to obtain aroma-producing strain，a fungus strain F036 were identified by morphological observation and rDNA ITS sequence analysis.The volatile aromatic compounds were prepared with simultaneous distillation and extraction equipment（SDE）from the culture broth of the strain，and identified by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.Strain F036 was observed to develop well branched substrate and aerial mycelia on PDA（Potato Dextrose Agar）medium，and the aerial mycelia were septate and milk-white with no spores after cultured for enough time，the optimum temperature was 34～36℃，the optimum pH value was 5～6，and with cellulose enzyme and lignin enzyme activity.The rDNA ITS gene sequence of strain F036 showed the highest similarities to Irpex lacteus（99%），with which it formed a distinct clade.Strain F036 was cultured in PDA medium for 3 days at 35℃ and 180 r/min，and then the culture broth was added 5%（V/V）ethanol and cultured for 4 days under the described condition above with the production of many aromatic components.Analysis of GC-MS suggested that the main aromatic compounds included methyl cinnamate（19.93%），ethyl cinnamate（19.66%），benzaldehyde（7.35%），3-Methylbutanol（3.85%），ethyl benzoate（2.82%）and Linalool（1.24%），etc.So，aroma-producing fungus strain F036 could produce many volatile aromatic compounds，and had potential value in development of natural perfume.

fungus；ITS sequence；volatile compounds；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.033

2014－12－16

杨建远（1979-），男，在读博士，讲师，研究方向：食品生物技术与食品营养，E-mail：yjy731@sohu.com。

张炳火（1968-），男，博士，副教授，研究方向：天然产物和微生物资源，E-mail：binghuozh@126.com。

九江学院校级科研项目（201320）；江西省科技支撑计划项目（20121BBF60048）。