水貂养殖舍中细菌气溶胶与气载内毒素检测

钟召兵

（泰安市岱岳区畜牧兽医局，山东泰安 271000）

水貂养殖舍中细菌气溶胶与气载内毒素检测

钟召兵

（泰安市岱岳区畜牧兽医局，山东泰安 271000）

［目的］本研究旨在了解水貂舍细菌气溶胶和气载内毒素对环境的污染及对饲养人员健康的潜在危害。［方法］采用Andersen-6空气收集器和AGІ-30液体冲击式采样器对市郊不同饲养条件的2个水貂场6栋养殖舍内的细菌气溶胶和气载内毒素进行定期检测。［结果］两个场舍内气载需氧革兰氏阴性菌浓度分别介于4.17×101～2.43×103CFU/m3之间和4.27×101～5.1×103CFU/m3之间，以大肠杆菌科为主，假单胞菌属和巴斯德氏菌属次之；从革兰氏阴性菌在Andersen-6空气收集器层级上的分布规律来看，主要分布在Ⅲ级（36.9%），气溶胶颗粒直径在2～6 mm之间。两个场舍内的气载内毒素浓度分别介于2.92×102～2.15×103EU/m3之间和2.67×101～2.56×102EU/m3之间。［结论］水貂舍内气溶胶颗粒可以进入到动物和人的支气管、细支气管，甚至肺泡，在一定程度上增加了水貂和饲养人员呼吸道疾病发生的可能性；气载内毒素的浓度部分超出了对人体无影响的推荐标准（1.0×102EU/m3），可对水貂饲养人员的健康造成一定的危害；舍内气载革兰氏阴性菌与内毒素之间没有必然的相关性，表明空气中气载内毒素含量不能用空气中气载革兰氏阴性菌的含量来评估。

水貂场；环境；气载需氧革兰氏阴性菌；气载内毒素

空气微生物的污染程度是衡量空气质量的重要指标之一。国外在畜禽舍环境与人类和动物的健康方面已做过很多研究［1］，空气中病原微生物可导致畜禽呼吸道感染［2］；高浓度的非病原微生物可导致机体免疫负荷过重，抵抗力降低，易感性升高［3］。特别是空气中的微生物及其代谢产物（内毒素、氨、硫化氢等）是影响动物健康的因素［4］。畜禽舍环境中微生物气溶胶不仅对畜禽和养殖人员的健康造成威胁，还对外界环境造成生物污染［5］。

细菌内毒素来源于革兰氏阴性菌细胞外壁，是其死亡或菌体裂解时释放出来的一类具有多种生物活性的毒性物质，可对机体产生毒害作用，如热源性、白细胞减少症、Shwartzman反应、内毒素毒血症和休克等［6］，因此对动物舍内气载内毒素检测有其必要性和重要性。

畜禽舍细菌气溶胶和气载内毒素对人类健康的影响在国外已有研究报道［7］，而对水貂舍内空气中细菌和内毒素检测以及内毒素和革兰氏阴性菌相关性的研究迄今为止国内外还没有报道。因此，本研究对水貂舍气载内毒素和气载革兰氏阴性细菌的浓度进行检测并分析其危害，对两者是否存在相关性做了研究，旨在对水貂养殖环境空气质量做出客观评价。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂、培养基。血琼脂基础（上海伊华医学科技有限公司）、50 mL/瓶的细菌内毒素检查用水（湛江经济技术开发区海洋生物制品厂）、LAL试 剂（0.1 mL/支，λ=0.125 EU/mL）（ 湛江博康海洋生物有限公司）、细菌内毒素标准品CSE（10 EU/支）（湛江博康海洋生物有限公司）。1.1.2 主要仪器。Andersen-6级撞击式微生物样品收集器（辽宁市应用技术研究所）、AGІ-30液体冲击式采样器（辽阳市医疗器械厂）、DEM6型轻便三杯风向风速表（天津市气象海洋仪器厂）、DH4000A型电热恒温培养箱（中国天津市泰斯特仪器有限公司）、YOX型厌氧培养箱（上海跃进医疗器械厂）、无菌超净工作台（苏净集团安泰公司制造）。

1.2方法

1.2.1血琼脂培养基的制备。将血琼脂基础灭菌后加5%公绵羊血制成血琼脂培养基。

1.2.2水貂舍的选择。选择A、B两个开放式和半封闭式水貂养殖场进行研究。其中，场A为开放式笼养，远离公路，占地约50亩，饲养水貂1100只左右；貂舍呈东西走向，背风向阳；采样地点为育成貂和仔貂舍A1、A2、A3，每栋舍长30 m、宽4 m、高2.5 m，养貂300只，通风条件良好；场B为半封闭式笼养，近邻国道，占地30亩，饲养水貂500只左右；貂舍呈东西走向；采样地点育成貂舍B1、B2、B3，舍长16m，宽4m，高2.5m，每舍养貂150只，自然通风，具体数据见表1。

表1 被研究的2个水貂场情况

1.2.3舍内空气样品采集。采用国际标准ANDERSEN-6级［8］空气微生物样品收集器（辽宁市应用技术研究所），置于水貂舍中央、高1 m、空气流量为28.3 L / min处，采样介质为血-葡萄糖-琼脂培养基，驱动时间1～5 min。

1.2.4舍内空气内毒素采集。通过国际标准AGІ-30液体冲击式采样器（All Glass Іmpinger AGІ-30）和鲎变形细胞溶解物试验（Limulus Amebocyte Lysate Test）测得。将收集器置于舍中央、高80 cm处，采样介质为50 mL内毒素检查用水（湛江海洋生物制品厂），空气流量为12.5 L/min，驱动时间30 min。

1.2.5舍内空气中革兰氏阴性菌的分离、鉴定与浓度计算。一半（72个）样本放入YQX型厌氧培养箱中（88%N2、7%H2、5%CO2），40 ℃培养24～48 h；另一半（72个）置于培养箱37℃培养24～48 h，阳性菌落经过“KOH 反应”试验鉴定其是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌。将革兰氏阴性菌通过O-F（氧化-发酵）试验和氧化酶试验分成肠杆菌科类和非发酵类，分别用APІ-20E和APІ- 20NE进行鉴定，经Andersen校正表校正后，计算出环境空气中细菌的浓度（CFU/m3）和气载革兰氏阴性菌浓度（CFU/m3）［9］。

2　结果

2.1数据分析

舍内空气微生物数据呈非正态分布，为减少误差达到准确反应实际真值的目的，水貂舍环境气载内毒素和细菌浓度采用了中间值（Median）［10］，这种统计方法适用于数量较少数值浮动较大的样本统计，同时用最大值与最小值反映数值的波动范围，并应用Microsoft Excel 对参数进行了相关性和回归分析。

2.2舍内气载细菌在Andersen-6级生物采集器各层级上的分布特征

Andersen-6级生物采集器Ⅰ-Ⅱ级收集的细菌粒子（＞6.0 mm）可沉着在小支气管内，Ⅲ-Ⅵ级收集的粒子（≤6.0 mm）可直接侵入肺泡。不同种类细菌粒子因直径大小不同，在不同级别上的分布比例也不同，气载细菌总体分布在Ⅰ～Ⅴ层。貂舍内气载细菌在Andersen-6级生物采集器各层级上的分布用每一层级捕获的细菌粒子数占采样器捕获的细菌粒子总数之比计算，具体数据见表2。

2.3貂舍内细菌气溶胶的浓度

场A与场B舍内空气中需氧菌浓度分别在4.32×102～2.35×104CFU/m3和 4.63×102～2.78×104CFU/ m3之间，厌氧菌浓度分别在6.18×102～1.12×104CFU/m3和 1.31×103～1.22×104CFU/ m3之间，具体数据见表3。

2.4貂舍内革兰氏阴性菌气溶胶的浓度

场A、场B舍内需氧革兰氏阴性菌的浓度分别在4.17×101～2.43×103CFU/m3和4.27×101～5.1×103CFU/m3之间，具体数据见表4，没有分离出气载厌氧革兰氏阴性菌。

2.5貂舍内气载内毒素的浓度

场A、场B舍内气载内毒素的浓度分别在2.92×102～2.15×103EU/m3和 2.67×101～2.56×102EU/m3之间，具体数据见表4，部分数据已超出了推荐的健康标准（1.0×102EU/m3）［11］。

2.5貂舍内气载需氧革兰氏阴性菌的菌群组成

场A、场B舍内空气中需氧革兰氏阴性菌以肠杆菌科为主，其中，大肠埃希氏菌占优势，巴氏杆菌属和假单胞菌属细菌浓度相近，巴氏杆菌属以多杀性巴氏杆菌最高，假单胞菌以铜绿假单胞菌为主。此外也检测到不常见的成团泛杆菌和成团肠杆菌，具体数据见表5、表6。

表2　水貂场舍内气载细菌在Andersen-6级生物采集器各层级上的分布（%）

表3　水貂场A和B舍内气载需氧活菌和气载厌氧活菌浓度

表4　水貂场A和B舍内气载需氧革兰氏阴性活菌和气载内毒素浓度

表5　水貂场A中需氧革兰氏阴性细菌的菌群构成

表6　水貂场B中需氧革兰氏阴性细菌的菌群构成

2.6貂舍空气中内毒素与革兰氏阴性菌的相关性分析

对水貂场A和B舍内空气中细菌内毒素和气载革兰氏阴性菌之间的相关性进行统计分析，结果表明，气载内毒素与气载革兰氏阴性菌之间相关系数r1和r2不显著，气载革兰氏阴性菌与气载内毒素没有必然的相关性，因此不可以用水貂舍气载革兰氏阴性菌浓度来估测气载内毒素，具体数据见表7。

表7　水貂场A和B舍内气载内毒素与革兰氏阴性菌之间的关系

3　讨论

3.1水貂场舍内气载细菌气溶胶的潜在危害

本研究采用Andersen-6级空气微生物收集器，采集粒谱范围在0.2～20 mm，可以统计各种直径粒子的数量，了解微生物气溶胶颗粒空气动力学直径（Dae50）大小，评估它们的传播距离和进入呼吸道的深度，判断能否进入肺泡和在空气中悬浮时间，间接推断对人及动物造成的危害程度。

两个水貂场舍内细菌气溶胶颗粒在Andersen-6收集器6个层级上的分布（表2）看出，场A和B舍内气载细菌在 Andersen-6级生物空气采样器上的粒径分布趋势基本相同。气载细菌主要分布在Ⅱ和Ⅳ级（捕获范围2.0～8.2 mm），最低值在Ⅵ级（＜0.65 mm）。根据饲养人员和水貂的吸气量以及在舍内的停留时间（饲养人员8 h，水貂24 h），人和水貂在1 d内可吸入3.1×103 CFU和5.4×104 CFU气载细菌，其中Ⅰ级和Ⅱ级上的气载细菌可进入人和水貂的鼻腔和上呼吸道，这些颗粒在空气中悬浮时间短，最多能通过鼻腔到达气管，但由于重力作用将很快沉落，一般情况下，对人和动物的威胁不大；但Ⅲ-Ⅵ级的气载细菌可以沉着在人和水貂的小支气管或直接侵入肺泡，对人和动物的健康构成威胁。

3.2水貂场舍内气载革兰氏阴性菌

本研究主要对两个水貂场舍内空气中的气载革兰氏阴性菌的组成和含量进行了分析，结果显示革兰氏阴性病原菌的浓度很低，虽然没有文献报道水貂舍内气载革兰氏阴性菌的标准范围，但是不能忽视它们对舍内环境空气的影响。

检测结果显示，气载革兰氏阴性菌群主要包括肠杆菌、巴氏杆菌和假单胞菌。其中，肠杆菌科在两个水貂场舍内空气的革兰氏阴性菌中占大多数，以大肠杆菌最多，这同报道的畜禽舍的情况基本一致［12-13］，都没有检出厌氧革兰氏阴性菌。高浓度非病原菌会导致机体免疫力降低，使病原菌侵入机体的可能性增加。

在两个水貂场内检测到很多种假单胞菌属，其是常见的条件致病菌，感染途径主要通过呼吸道，可引起人的肺炎、肺栓塞、手术创伤感染、菌血症与败血症等病症［14］。另外在两个场中还分离到巴氏杆菌，其中多杀巴氏杆菌能导致人上呼吸道感染以及生殖道感染等病症。

场A舍内还分离到了鸡巴氏杆菌，分析可能与舍内有鸡混养有关；还分离到了不常见的成团肠杆菌和成团泛杆菌，含量极少。成团肠杆菌是免疫系统缺陷病人的条件致病菌，常侵犯新生儿和创伤病人。

场B舍内气载革兰氏阴性菌浓度比场A高（表3），可能与这两个场的养殖环境有关，场A是开放式养殖，通风状况良好，有一套完整有序的消毒和疾病控制体系；场B是半封闭式养殖，通风条件相对较差并且鸡狗混养，这些因素都可导致气载致病性革兰氏阴性菌浓度升高。

从水貂场舍内空气中分离的气载革兰氏阴性菌群组成及浓度反映出水貂场存在发生疾病的潜在危险，尤其对在半封闭式水貂场内的饲养人员和动物的健康危害更大。

3.3水貂场舍内空气中内毒素

国外研究表明，空气中内毒素可以造成人及动物严重的呼吸道刺激反应［15］；气载内毒素含量与动物疾病的发生有协同作用，长期暴露在有气载内毒素存在的环境中，可导致肺功能下降，甚至导致免疫性疾病［16］。Halloy通过研究内毒素含量对猪的健康影响，表明气载内毒素可以导致猪发生多方面呼吸道疾病［17］，Donham通过相关性和回归性分析发现了重要的剂量反应关系，指出0.16 mg/m3可被吸入的尘埃，614 EU/m3的内毒素以及12ppm的氨气与肺部损伤有很大的相关性［18］。

本研究在两个不同水貂场舍内测得气载内毒素含量在2.67×101～2.15×103EU/m3之间，部分已超过引起人的肺炎推荐标准（2.0×103EU/m3），大部分已经超了对人体健康无影响推荐标准（1.0×102EU/m3）。对长期生活在这种环境中的动物和饲养人员的健康会产生很大的危害。然而舍内气载内毒素对动物和饲养人员的健康会产生多大的危害及其含量在多少之内不会影响动物和人的健康等问题，还有待研究。

3.4水貂舍内气载革兰氏阴性菌与气载内毒素的相关性

通过舍内气载革兰氏阴性菌与内毒素的相关性分析，说明两者之间没有必然的相关性，且气载内毒素依赖于气载革兰氏阴性菌的回归方程（见表7）也不显著（P＞0.05）。表明空气中气载内毒素含量不能用空气中气载革兰氏阴性菌的含量来评估。气载内毒素的活性可保持数月，其含量可以积累，而革兰氏阴性细菌在空气中存活时间短，采样过程也可使其活性丧失［19-20］。

综上所述，水貂舍环境中高含量的气载细菌和气载内毒素，不仅会危及人和动物的健康，还可能造成周围环境的空气污染。尽管在采样过程中未观察到人和水貂的异常表现，但长期暴露在这种环境中会给人和动物的健康造成危害，因此关注畜禽养殖环境卫生是健康养殖的重要环节。

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（责任编辑：朱迪国）

Detection of Bacterial Aerosol and Airborne Endotoxin in Mink Breeding Houses

Zhong Zhaobing
（Daiyue District Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Tai，an，Shandong 271000）

［Objective］The purpose of the study is to understand bacterial aerosol and airborne endotoxin pollution in the mink stables and the potential health hazards to mink breeders. ［Methods］Concentrations of bacteria aerosol and airborne endotoxin were measured by Andersen-6 stage sampler and AGІ-30（All Glass Іmpinger AGІ-30） in six stables of two mink farms in the suburbs. ［Results］Concentrations of airborne aerobic gram-negative bacteria were 4.17×101to 2.43×103CFU/m3and 4.27×101to 5.1×103CFU/m3respectively in the two farms with Enterobacteriaceae as the predominant species flowed by Pasteurella and the Pseudomonas. The airborne gram-negative bacteria were mainly distributed in the Ⅲ stage（36.9%）of Andersen-6 stage sampler，with aerosol particle diameters ranging from 2μm to 6μm. Concentrations of airborne endotoxin in two mink farms were 2.92×102to 2.15×103EU/m3and 2.67×101to 2.56×102EU/m3respectively.［Conclusion］The pollution of aerosol aerobic gram-negative bacteria detected in the mink stables，although with very low concentration，would increase possibilities of minks and the breeders to suffer from respiratory diseases. Concentrations of airborne endotoxin was above the recommended standard for human health（1.0×102EU/m3）and would have certain threat to the health of mink breeders. There is no inevitable correlation between the airborne gram-negative bacteria and endotoxins in mink houses，suggesting that airborne endotoxin concentrations can not be used to assess the concentration of gram-negative bacteria.

mink field；environment；airborne aerobic gram-negative bacteria；airborne endotoxin

S851.2+4

B

1005-944X（2015）11-0022-05