猪繁殖与呼吸综合征与大肠杆菌混合感染病例诊断报告

李　恒，程敏姮，佘锐萍，朱日宁，李　威，王晓阳，张　洋，吴桥兴，石蕊寒，胡凤娇

（中国农业大学动物医学院，北京　100193）

猪繁殖与呼吸综合征与大肠杆菌混合感染病例诊断报告

李恒，程敏姮，佘锐萍，朱日宁，李威，王晓阳，张洋，吴桥兴，石蕊寒，胡凤娇

（中国农业大学动物医学院，北京100193）

2014年3月，北京某规模化猪场发病，病猪表现为呼吸困难、耳朵发绀、体温升高、进食减少、眼结膜发炎等临床症状。通过组织病理学、分子生物学结合病原学方法，对该猪场病死仔猪检测分析。大体剖检结果显示肺脏干酪样变，肾脏肿大，淋巴结呈黑红色；组织病理学结果显示仔猪肺脏严重出血，肠道大面积坏死。PCR检测PRRSV和大肠杆菌阳性。综合诊断该猪场混合感染猪繁殖与呼吸综合征病毒与致病性大肠杆菌，从而导致严重的出血性肺炎和坏死性肠炎，引起仔猪死亡。

种猪；蓝耳病；呼吸障碍；坏死性肠炎；致病性大肠杆菌；混合感染

2014年3月北京某规模化猪场发生大小育肥猪发病、仔猪病死情况。该猪群持续发病3天，死亡6头。其主要症状表现为眼结膜潮红、喘气、呼吸困难、体温升高、进食减少、耳朵发绀、腹下皮肤呈紫色、有点状出血、精神萎靡。根据临床症状及大体剖检诊断结果，我们推测该规模化猪场可能感染PRRSV或者PCV2。本实验室通过组织病理学、分子生物学方法，对猪场发病猪进行实验室诊断。现报道如下：

1　材料与方法

1.1病料

患病仔猪2头，来源于北京某规模化猪场。

1.2剖检取材

取内脏器官于25mL/L 戊二醛-多聚甲醛混合液充分固定后，常规方法制成石蜡切片，进行HE染色。重点观察心脏、肾脏、肺脏、肝脏、脾脏和胃肠道的病理学变化，OLYMPUS 显微镜拍照。

1.3细菌学检查

无菌条件下，采取病猪组织（肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏）分别接种普通琼脂培养基和麦康凯培养基，37℃培养18～24 h，挑取培养基上的菌落，纯培养。

1.4细菌PCR检测、测序

细菌纯培养后，挑取单个菌落用16s RNA细菌通用引物［1］进行PCR检测，上游引物序列为gagtttgatcmtggctcag，下游引物序列为ctahagggtatctaatcct，目的片段大小约为750 bp。

PCR体系：Taq酶12.5 μL，待检模板1 μL，上下游引物各1 μL，灭菌水9.5 μL，PCR反应程序为： 95℃5 min；94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 90 s，35个循环；72℃ 8 min。PCR扩增产物送华大基因公司测序。

1.5病毒学检查

根据病理组织学观察，怀疑病猪可能是PCV2或 PRRSV感染。因此，我们采用PCV2和PRRSV 的引物对病死猪的肝脏、肾脏和肺脏组织进行PCR检测。PRRSV上游引物序列为CCAAATAACAACGGCAAGCA，下游引物序列为ATGCTGAGGGTGATGCTGTGA，目的片段大小332bp［2］。PCV2 ORF2上游引物序列为CACGGATATTGTAGTCCTGGT，下游引物序列为CCGCACCTTCGGATATACTGTC［3］。

PCR体系：Taq酶12.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，灭菌水9.5 μL，PCR反应程序为95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 45 s，共35个循环；72℃ 10 min。PCR扩增产物送华大基因公司测序。

2　结果

2.1大体剖解观察

病猪被毛粗糙，肝门周围有分泌物附着，且有紫色瘀斑和血痂（图1）。体表淋巴结呈砖红色，部分淋巴结呈黑红色，切面外翻（图2）。肾脏肿大，边缘钝圆（图3、4）。肺脏病变严重，可见肺脏呈现大面积的干酪样变，触摸质地坚实（图5）；心壁柔软，心腔内有血凝块（图6）。

2.2组织病理学观察结果

（1）肺脏：肺正常组织结构被破坏，红细胞和炎性细胞充满整个肺组织（图7）；支气管细支气管内有炎性细胞和脱落的上皮细胞浸润，管腔内还有纤维蛋白渗出（图8）；肺脏血管周围大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主（图9）。

（2）十二指肠：肠粘膜上皮坏死脱落，固有层裸露，水肿（图10）。

（3）心脏：心外膜下有少量炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主 ；心肌纤维变性坏死，发生波浪样变（图11）。

（4）肝脏：肝脏淤血，小叶间间质和汇管区周围有少量炎性细胞浸润，中央静脉内淤血，肝细胞肿胀，发生明显的颗粒变性（图12、13）。

图1 紫色瘀斑和血痂　

图2 黑红色淋巴结

图3 肾脏肿大

图4肾脏切面外翻　

图5 肺实变　

图6 心腔内血凝块

图7 肺脏正常结构破坏 HE20X　

图8 细支气管内蛋白样渗出 HE20X

图9血管扩张充血 HE40X

图10肠粘膜上皮坏死脱落HE10X　

图11 心肌波浪样变 HE20X

图12 肝脏炎性细胞浸润 HE40X

图13 肝脏颗粒变性 HE40X　

图14 脾脏白髓淋巴滤泡排空 HE40X　

图15 淋巴结水肿，弥散性出血 HE40X

图16 细菌16SRNA PCR检测条带

图17　肝、肺、肾PRRSV PCR检测条带

（5）脾脏：脾脏的白髓区发生散在的淋巴细胞排空现象，局部出血（图14）。

（6）淋巴结：全身各淋巴组织坏死严重，大量淋巴细胞排空，被膜下有大量含铁血黄素沉着，小梁周隙增宽，淋巴结水肿，呈弥散性出血（图15）。

2.3细菌PCR检测结果

用细菌的通用引物16s rRNA，对培养出的细菌作PCR检测，电泳结果如图16。测序结果为大肠杆菌。与现有报道的致病性猪源大肠杆菌同源性高达100%（登录号：KT388747）。

2.4病毒PCR检测结果

PRRSV引物PCR扩增结果显示，在肝、肺、肾的组织中均检测到一条320 bp左右的阳性条带（图17），与PRRSV 预期扩增片段相符。测序结果登陆GenBank进行BLAST比对，与现有报道的PRRSV同源性高达99%。而用PCV2引物为模板未扩增出阳性条带。

2.5病毒基因进化树分析

将测得的该毒株ORF7基因序列和国内外PRRSV毒株核苷酸序列利用MegAlign软件构建系统发育进化树，测得该PRRSV毒株为North American型 （图18）。系统发育树分析表明，该高致病性PRRSV与HUB-2株，HUN-4株遗传关系较近，处于同一分支；与LV株遗传关系较远，属于不同基因型的PRRSV。

图18 PRRSV毒株与参比毒株基因系统进化树

3　讨论

病毒感染导致机体肝脏、肾脏受损，肺肿胀、变硬、干酪样坏死，并以大叶性肺炎或出血性肺炎为特征［4］，给各地猪场造成巨大的经济损失。本病例中可见病猪肺脏结构被破坏，红细胞和炎性细胞充满整个肺组织，肺泡堵塞，呼吸困难；全身各淋巴组织坏死严重，大量淋巴细胞排空，中性粒细胞浸润，提示细菌感染［5］。通过PCR检测结果显示，我们在各器官内均检测到了猪繁殖与呼吸综合征病毒和致病性大肠杆菌，病原菌的混合感染导致机体肠道粘膜受损，出现出血性肺炎和坏死性肠炎，是引起仔猪死亡的原因。

目前猪场中多数疫情均为混合感染，其中以高致病性繁殖与呼吸综合征为主的重大疫病危害巨大［6］。因此，对PRRS这一疾病我们应该高度重视，及时注射疫苗，做好相关生物安全防护工作，严格卫生管理制度，做好猪场的卫生消毒工作，严格阻断病原微生物的感染与传播。

4　结论

北京某规模化猪场仔猪发病，综合流行病学调查、临床症状观察、病理组织学观察和病原学检测，确定本次猪病为猪繁殖与呼吸综合征病毒与致病性大肠杆菌混合感染，从而导致严重的出血性肺炎和坏死性肠炎，引发仔猪死亡。混合感染病变严重，感染率高、死亡率高，所以应引起集约化大规模养猪场管理者的高度重视，坚持合理用药，以保障养猪业的健康发展。

［1］ 万志明，汤耀卿，韩天权，等. 细菌通用引物PCR快速诊断全身性感染的研究［J］. 外科理论与实践，1998（2）： 84-87.

［2］ Mao J J，Zhao Y. One case of swine hepatitis E virus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus coinfection in weaned pigs［J］. Virol J，2013，10（1）： 341.

［3］ Hamel A L，Lin L L，Sachvie C，et al. PCR detection and characterization of type-2 porcine circovirus. Can J Vet Res，2000，64（1）： 44-52.

［4］ 张妙红. 猪高致病性蓝耳病病理学研究［D］. 长沙：湖南农业大学，2008.

［5］ 贾蓓，钱元恕. 中性粒细胞在细菌感染中的免疫调节作用［J］. 国外医药（抗生素分册），2004（2）： 61-63.

［6］ 石丽娟. 猪繁殖与呼吸障碍综合征的防治［J］. 湖北畜牧兽医，2015（2）： 21-23.

（责任编辑：胡藕祥）

A Diagnostic Report on Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome and Escherichia coli Co-infection in Swine

Li Heng，Cheng Minheng，She Ruiping，Zhu Rining，Li Wei，Wang Xiaoyang，Zhang Yang，Wu Qiaoxing，Shi Ruihan，Hu Fengjiao
（College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193）

Large number of pigs in a pig farm of Beijing suffered from a disease in March 2014，manifested as dyspnea，skin cyanosis，hyperthermia，decreased appetite，conjunctiva inflammation and other clinic symptoms. Severe pathological changes were observed： pulmonary caseation，kidney enlargement and black and red lymph nodes. The histopathological findings included severe pulmonary hemorrhage and intestinal tractnecrosis. PCR was used to identify the pathogen. The results showed that these swine were infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and pathogenic Escherichia coli，resulting in hemorrhagic pneumonia and necrotic enteritis，finally causing pig deaths. Key words： swine；PRRS；pathogenic E. coli； respiratory disorder；necrotic enteritis；co-infection

S858.28

B

1005-944X（2015）11-0080-04

佘锐萍