花生粕双菌固态发酵的工艺研究

毛晓宇，林思敏，张春雨，陈晓丹，赖建平，周勇强，曾庆祝

（广州大学化学化工学院，广东广州510006）

花生粕双菌固态发酵的工艺研究

毛晓宇，林思敏，张春雨，陈晓丹，赖建平，周勇强，曾庆祝*

（广州大学化学化工学院，广东广州510006）

以热榨花生粕为原料，水解度（DH）为指标，米曲霉AS3.951与枯草芽孢杆菌1.398结合对花生粕进行发酵并确定了接种时间差，通过实验确定最佳接种时间差为3 h。正交试验得出双菌发酵最适工艺条件：花生含量90%、温度32℃、接种比例1∶2、接种量10%、时间72 h。在此条件下，水解度达33.81%，氮溶解指数达85.65%。

花生粕；固态发酵；水解度；混菌

花生粕是花生仁经压榨提油后的副产品，含丰富的植物蛋白。花生粕的营养价值较高，其代谢能是粕类饲料中最高的，粗蛋白含量达48%以上［1］。然而由于花生粕蛋白质品质欠佳，氨基酸不平衡，同时很容易感染黄曲霉菌而产生黄曲霉毒素，从而在一定程度上限制了花生粕的高效利用［2-3］。解决上述的问题，主要是利用酶解、发酵等生物方法。与单一酶解相比，发酵的优势在于：在酶解蛋白质的同时，可以利用微生物的代谢产生大量的活性物质或成味物质［4］。本研究采用米曲霉与枯草芽孢杆菌双菌固态发酵花生粕，以代表多肽或氨基酸含量的蛋白质水解度为指标，通过正交试验确定最佳工艺条件，使花生粕中的蛋白质最大限度分解为多肽或氨基酸，从而提高花生粕的营养价值和利用率。

1材料与方法

1.1材料

热榨花生粕；枯草芽孢杆菌1.398：上海市工业微生物研究所；米曲霉AS3.951：广东省微生物菌种保藏中心；麸皮：市场购买；营养琼脂培养基；PDA培养基；种子培养基（水分含量64%，花生粕∶麸皮=9∶1，水分含量64%）。

1.2主要设备

ZSD-1270生化培养箱、ZHJH-1112垂直流超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；PHS-25数显pH计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1斜面培养及种子培养

1.3.1.1米曲霉AS3.951

PDA斜面保藏菌种培养：28℃恒温培养4 d后，于4℃冰箱保存。

一级斜面种子：刮取一环保藏菌种接种到PDA斜面上培养4 d。

二级三角瓶种曲：取灭菌生理盐水9 mL将一级斜面菌种的孢子完全冲下，并全部转移到99 mL的灭菌生理盐水中，取0.10 mL接种到装料量为30 g/250 mL的三角瓶中，于28℃恒温培养60 h。

扩大培养：称取0.10 g三角瓶种曲于装料量为30 g/250 mL的三角瓶中，于28℃恒温培养60 h。

1.3.1.2枯草芽孢杆菌1.398

营养琼脂斜面保藏菌种培养：30℃恒温培养24 h后，于4℃冰箱保存。

一级斜面种子：刮取一环保藏菌种接种到营养琼脂斜面上培养24 h。

二级三角瓶种曲：取灭菌生理盐水9 mL将一级斜面菌种的孢子完全冲下，并全部转移到99 mL的灭菌生理盐水中，取1.00 mL接种到装料量为30 g/250 mL的三角瓶中，于30℃恒温培养60 h。

扩大培养：称取1.00 g三角瓶种曲于装料量为30 g/250 mL的三角瓶中，于30℃恒温培养60 h。

1.3.2固态发酵条件优化

花生粕→预处理（粉碎，过40目筛）→配制固态发酵培养基→121℃灭菌30 min→接种→发酵（各因素对发酵影响）→取样加水溶解→离心→上清液适当稀释→甲醛滴定法测定花生发酵水解度。

在发酵过程中，影响发酵花生粕产多肽因素有发酵时间、温度、接种比例、接种量、花生含量等，分别在初始条件基础上进行单因素及正交试验，确定花生粕发酵的最佳工艺条件。

1.3.3水解度（DH）测定

水解度测定采用甲醛滴定法［5］。

2结果与讨论

2.1单因素实验

2.1.1花生粕含量对水解度的影响

在自然pH下，培养基含水量为64%，接种量为固态物料的10%，接种比例为米曲霉∶枯草芽孢杆菌＝1∶1，接种时间差为3 h，分别于固态物料中花生粕含量为60%、70%、80%、90%、100%，于30℃下发酵56 h，结果见图1。可知，固态物料中花生粕的含量由60%增加到90%时，发酵料的水解度呈缓慢上升的趋势，当花生粕含量大于90%时，水解度随花生粕含量的增加而下降，这是因为两种发酵菌种均是好气性微生物，而麸皮具有支持培养基结构，利于通风、保持水分等作用［6］且在麸皮还含有大量微生物所需要的生物素，适量加入麸皮有利于菌体的生长繁殖，故选取发酵培养基中加入花生粕和麸皮两种固态物料的量分别为90%和10%。

图1　温度对混合发酵过程中水解度的影响Fig.1Effects of peanut meal content on DH in the mixed fermentation process

2.1.2发酵温度对水解度的影响

在自然pH下，培养基含水量为64%，固态物料中花生粕含量为90%、麸皮含量为10%，接种量为固态物料的10%，接种比例为米曲霉∶枯草芽孢杆菌＝1∶1，接种时间差为3 h，分别于22、26、30、34、38℃下发酵56 h，结果见图2。

图2　温度对混合发酵过程中水解度的影响Fig.2Effects of different fermentation temperature on DH in the mixed fermentation process

由图2可知，温度对枯草芽孢杆菌与米曲霉混合发酵花生粕的水解度的影响比较明显。由22℃到30℃过程中，水解度随发酵温度的增加而呈直线上升的趋势，在30℃时，水解度到达最大值，30℃以后，水解度呈下降趋势。故选取30℃为最适发酵温度。

2.1.3不同菌种混合比例对水解度的影响

在自然pH下，培养基含水量为64%，固态物料中花生粕含量为90%、麸皮含量为10%，接种量为固态物料的10%，接种时间差为3h，接种比例分别为米曲霉∶枯草芽孢杆菌＝1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，于30℃下发酵56 h，结果见图3。

由图3可知，米曲霉∶枯草芽孢杆菌由1∶3到1∶1时，水解度呈上升趋势。在米曲霉：枯草芽孢杆菌为1∶1时水解度达到最大值。此后，随着枯草芽孢杆菌比例的增加，水解度呈下降趋势，故选取两种菌种的混合比例为1∶1。

图3　不同菌种混合比例对混合发酵过程中水解度的影响Fig.3Effects of mixing ratio of different microbial strain on DH in the mixed fermentation process

2.1.4接种量对水解度的影响

在自然pH下，培养基含水量为64%，固态物料中花生粕含量为90%、麸皮含量为10%，接种比例为米曲霉∶枯草芽孢杆菌＝1∶1，接种时间差为3h，接种量为固态物料的1%、4%、7%、10%、13%、16%，于30℃下发酵56 h，结果见图4。

图4　接种量对混合发酵过程中水解度的影响Fig.4Effects of inoculation size on DH in the mixed fermentation process

由图4可知，接种量为1%到7%时，水解度随接种量增大而增大，接种量高于7%后，水解度增加平缓，且略有下降的趋势。原因可能是随着接种量的增大，花生粕中的营养物质被用于微生物的生长繁殖，而导致了水解度下降。故选取接种量为7%。

2.1.5发酵时间对水解度的影响

在自然pH下，培养基含水量为64%，固态物料中花生粕含量为90%、麸皮含量为10%，接种量为固态物料的7%，接种比例为米曲霉∶枯草芽孢杆菌＝1∶1，发酵温度30℃，接种时间差为3 h，从48 h开始，每隔8 h测定发酵料的水解度，测定结果如图5。

图5　混合发酵过程中水解度随时间的变化趋势Fig.5Variation trend of DH in mixed fermentation process with time

由图5可知，米曲霉与枯草芽孢杆菌混合发酵花生粕的过程中，从发酵48 h到72 h这一阶段，水解度增加显著，水解度增大约5%。这是由于米曲霉和枯草芽孢杆菌生长繁殖，产生大量的酶，酶的活性不断增强，进而促进花生粕中的蛋白质等大分子物质的降解，因此水解度快速升高。发酵56 h核实并确定究竟是54 h还是56 h后随着时间的延长，水解度变化不明显，可能是菌体的大量积累，培养基中的营养物质已被消耗大量消耗，菌体生长进入了稳定期，甚至衰亡期，菌体大量死亡，故分泌蛋白酶的能力下降。所以发酵的时间为72 h最适宜。

2.2正交试验结果

为了进一步优化发酵条件，在上述单因素基础上，选取温度、接种比例、接种量进行正交试验，因素水平表见表1，采用发酵料的水解度作为指标进行评价。结果见表2。

表1　因素水平表Table 1Orthogonal factor in the level of table

表2　L9（33）正交试验表Table 2Orthogonal test result

由表2可以得出，对混合菌种发酵花生粕的水解度影响最大的因素是温度，其次是接种量和接种比例，通过极差分析得到最优组合为A3B3C3。为了验证结果的准确性，根据极差分析所得的最佳工艺条件A3B3C3与正交表中水解度最大的第7号试验A3B1C3做对比试验，得到结果为DH（A3B3C3）=32.94%，DH（A3B1C3）=33.81%，所以第7号试验A3B1C3是所需的最优方案。

3结论

通过单因素实验与正交试验可以得出米曲霉与枯草芽孢杆菌混合固态发酵花生粕的最佳工艺条件：温度32℃，接种比例1∶2，接种量10%，花生粕含量90%、时间72 h。此方案所得水解度为33.81%，氮溶解指数达85.65%。

［1］梅娜，周文明，胡晓玉.花生粕营养成分分析［J］.西北农业学报，2007，16（3）:96-99

［2］PESTIG M，BAKALLI R I，DR IVER JP，et al.Com parison of peanut meal and soybean meal as protein supplements for laying hens［J］. Poultry Science，2003，82:1274-1280

［3］COSTA E F，MILLER BR，PESTIG M，et al.Studies on feeding peanut mealasaproteinsource for broiler chickens［J］.Poultry Science，2001，80:306-313

［4］蔡国林，郑兵兵，王刚，等.微生物发酵提高花生粕营养价值的初步研究［J］.中国油脂，2010，35（5）:31-34

［5］徐勤，葛向阳，刘建峰.甲醛法测大豆蛋白水解度的改进［J］.饲料工业，2008，29（5）:46-47

［6］活泼，茆军，石玉瑚.耐热芽孢杆菌高温中性蛋白酶制备工艺研究［J］.生物技术，2003，13（4）:6-27

Research on Improving Nutritional Value of Peanut Meal by Solid-state Fermentation with Manifold Strains

MAO Xiao-yu，LIN Si-min，ZHANG Chun-yu，CHEN Xiao-dan，LAI Jian-ping，ZHOU Yong-qiang，ZENG Qing-zhu*
（College of Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

In the research hot pressed peanut cake was fermented with Aspergillus oryzae AS3.951 and Bacillus subtilis 1.398.The results showed that the optimal conditions were as follows：fermentation temperature，32℃；inoculation proportion，1∶2；inoculum size，10%；peanut content，90%；time，72 h.Under the optimized conditions，the DH（%）and NSI（%）reached 33.81%and 85.65%respectively.

peanut meal；solid-state fermentation；DH；manifold strains

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.024

2013-11-16

广东省大学生创新实验项目（1107812003）；第十三届全国挑战杯校级项目以及广州市科技计划项目（12C12011620）共同资助

毛晓宇（1991—），男（汉），本科生，研究方向：农副产品综合利用。

曾庆祝（1965—），男，教授，博士，主要从事生物活性物质制备及功能性研究。