樱桃核中类黄酮的提取工艺条件研究

孙海燕

（1.陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723000；2.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

樱桃核中类黄酮的提取工艺条件研究

孙海燕1，2

（1.陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723000；2.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

研究提取樱桃核中的功能成分类黄酮（Flavonoids）的最佳工艺条件。以类黄酮的提取率为考察指标，考察乙醇浓度、液固比、提取温度和提取时间对类黄酮得率的影响。分别采用单因素试验和正交试验对樱桃核中类黄酮提取工艺进行优化。结果显示，樱桃核中类黄酮最佳提取条件为：乙醇浓度为75%（体积分数），液固比35∶1 mL/g，提取温度65℃，提取时间2 h，在此提取条件下类黄酮的提取率最高可达0.803%。

樱桃核；类黄酮；提取工艺

汉中樱桃沟是著名的旅游胜地，所产樱桃非常受欢迎，给当地带来了很高的经济效益，但随之而来的就是樱桃核被当作废物扔得遍地都是，其实樱桃核的主要成分类黄酮有很高的利用价值。研究表明，类黄酮化合物具有抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等功效［1-4］；还可以作为添加剂应用到食品中。近年来，随着类黄酮生物活性的揭示，对其的开发研究成为众多科研者所工作的焦点。

本试验以汉中市西乡樱桃核为原料，探索了樱桃核中类黄酮的最佳提取工艺条件，以期为汉中樱桃核的后期产业化发展提供理论参考，变废为宝。

1材料与方法

1.1材料与试剂

樱桃核：汉中市西乡樱桃核；芦丁（生化试剂）：上海沪宇试剂有限公司；其他试剂（乙醇、石油醚等）均为分析纯，水为蒸馏水。

1.2主要仪器

UV-2550型紫外可见分光光度计：苏州岛津仪器有限公司；电子天平：北京市赛多利斯科学仪器有限公司；DGH-9055A型电热恒温鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器有限公司；数显恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；离心机：上海安亭科学仪器厂；等。

1.3试验方法

1.3.1工艺流程

樱桃核→晒干→去外壳→核仁粉碎→过40目筛→脱脂→真空干燥→提取→离心→除杂→二次离心→合并上清液→待测

1.3.2标准曲线的绘制

1.3.2.1芦丁标准曲线的绘制

总黄酮的含量测定采用硝酸铝分光光度法（芦丁为标准品）精确称取干燥后的芦丁10 mg，用30%乙醇溶解，定容到250 mL容量瓶中，准确量取0、1、2、3、4、5 mL于25 mL比色管中，用30%乙醇补充至12.5 mL，加入0.7 mL NaNO2（1∶20，g/mL），摇匀，放置5 min后加入0.7 mL Al（NO3）3（1∶10，g/mL），摇匀，6 min后再加入5 mL、1 mol/L NaOH，混匀，用30%乙醇定容到刻度，以30%乙醇为空白参比，用紫外分光光度法在509 nm测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标绘出标准曲线（y=0.416 4x+0.000 2，R2=0.999 7）。

1.3.2.2类黄酮含量测定

用30%乙醇将样品提取液定容至10mL容量瓶中，再准确吸取4 mL至25 mL带刻度的试管中，用30%乙醇补充至12.5mL，加入0.7mLNaNO2（1∶20，g/mL），摇匀，放置5 min后加入0.7 mLAl（NO3）3（1∶10，g/mL），摇匀，6 min后再加入5 mL、1 mol/L NaOH，混匀，用30%乙醇定容到刻度，以空白试剂（30%乙醇）作为参比，用紫外分光光度法在509 nm测定吸光度值。由标准曲线公式计算出提取溶液中类黄酮的浓度。

1.4类黄酮最佳提取工艺优化

1.4.1单因素试验

选取乙醇浓度、液固比、提取温度、提取时间做单因素试验，以确定相关因素及各因素的合适范围。

1.4.2正交试验

运用正交试验设计来优化类黄酮提取工艺，在单因素试验基础上，选取乙醇浓度、液固比、提取温度、提取时间进行四因素三水平进行正交试验。因素水平见表1。

表1　正交试验设计表Table 1Factors and levels of orthogonal test

2结果与分析

2.1芦丁标准曲线的绘制及类黄酮含量的计算

按照1.3.2的操作步骤得到数据绘制标准曲线见图1，得回归方程y=0.416 4x+0.000 2，R2=0.999 7。

类黄酮得率的计算：

图1　芦丁标准曲线图Fig.1Standard curve of rutin

式中：V0为测定吸光度值的样品稀释液定容后的体积，mL；V为样品提取液稀释后的体积，mL；V1为测定吸光度值所吸取样品稀释液的体积，mL；W为称取樱桃核的重量，g。

2.2类黄酮提取单因素试验

2.2.1乙醇浓度对类黄酮得率的影响

称取一定量的樱桃核粉，在液固比40∶1 mL/g，提取温度70℃，提取时间2 h的固定条件下，乙醇浓度对类黄酮得率的影响结果见图2。

图2　乙醇浓度对类黄酮得率的影响Fig.2Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction

由图2可知，随着乙醇浓度的增加，类黄酮化合物的提取量增加，乙醇浓度为70%时，提取量最大，当乙醇浓度再增加时，提取量开始降低。这可能是因为乙醇浓度较低时，提取液中蛋白质、糖类等水溶性物质大量溶出，杂质含量较高；而醇浓度过高，醇溶性杂质、色素、亲脂性强的物质溶出量增加，从而影响到类黄酮的溶出［6］。所以正交试验选择乙醇浓度为60%～80%。

2.2.2液固比对类黄酮得率的影响

称取一定量的樱桃核粉，在料液比乙醇浓度70%（体积分数），提取温度70℃，提取时间2 h的固定条件下，液固比对类黄酮得率的影响结果见图3。

由图3可知，类黄酮得率随着液固比的增大而增大，在15∶1 mL/g～45∶1 mL/g范围内增加的速度比较快，在45∶1 mL/g～55∶1 mL/g范围内增加的速度明显较慢。其原因在于：液固比影响溶剂的极性，从而影响了不同极性的类黄酮的溶解性；当液固比越大，乙醇中提取出的类黄酮类物质浓度相对较小，传质阻力较小，有利于物质的溶出；但液固比太大，后续处理时间延长，对热不稳定的类黄酮而言，可能会被氧化分解，从而不利于物质的提取率。综合考虑浸提效果、溶剂用量和浓缩负荷等因素，正交试验可选择液固比25∶1 mL/g～45∶1 mL/g。

图3　液固比对类黄酮得率的影响Fig.3Effect of ratio of solvent to material on flavonoids extraction

2.2.3提取温度对类黄酮得率的影响

称取一定量的樱桃核粉，在液固比40∶1 mL/g，乙醇浓度70%（体积分数），提取时间2 h的固定条件下，提取温度对类黄酮得率的影响结果见图4。

图4　提取温度对类黄酮得率的影响Fig.4Effect of temperature on flavonoids extraction

由图4可知，随着温度的升高，类黄酮得率也升高，即在乙醇中的溶解度增加。但是当温度升到80℃后，提取率不再升高，原因可能是由于温度过高，使类黄酮的活性遭到破坏，一些热稳定性不强的类黄酮类物质被氧化分解，从而使类黄酮提取率下降。此外，高温还可引起杂质的溶出量增加，所以后续的正交试验选择提取温度为60℃～80℃。

2.2.4提取时间对类黄酮得率的影响

称取一定量的樱桃核粉，在液固比40∶1 mL/g，提取温度70℃，乙醇浓度70%（体积分数）的固定条件下，提取时间对类黄酮得率的影响结果见图5。

由图5可知，在0.5 h～2 h阶段类黄酮得率升高速度较快，即在此条件下，类黄酮的溶出率随提取时间的增加而增加。而超过2 h后，类黄酮得率的增加速度变得非常缓慢。其原因在于：提取包括扩散、渗透和溶解等过程，时间的增加有助于类黄酮类化合物的溶出，从而提取率呈上升趋势，2 h后类黄酮提取基本完全，随着时间的增加提取率变化不大。所以，正交试验选择提取时间为1 h～3 h为宜。

图5　提取时间对类黄酮得率的影响Fig.5Effect of time on flavonoids extraction

2.3正交试验结果及分析

正交试验结果及方差分析结果见表2；方差分析见表3。

表2　类黄酮提取工艺优化正交试验结果Table 2Rasults and analysis of orthogonal test L9（34）

表3　正交试验结果方差分析Table 3Variance analysis

结合表2可以看出，各因素对类黄酮得率影响的主次顺序为：乙醇浓度＞液固比＞提取时间＞提取温度。由表3中的方差分析得，提取时间对类黄酮提取率的影响不甚显著，故综合考虑，确定最佳提取条件为A3B2C1D2，即乙醇浓度75%（体积分数），液固比35∶1 mL/g，提取温度65℃，提取时间2 h。

2.4最佳工艺条件验证

取同一批次的脱脂样品，按照优化出的最优条件，进行3次平行试验，结果如表4。

表4　最佳工艺条件验证Table 4 Validation of the Optimum conditions

3结论

樱桃核中类黄酮的较佳的提取工艺为索氏醇提法，通过单因素试验和正交试验优化索氏醇提法的提取条件。经实验得出，乙醇浓度、提取温度、液固比和提取时间对类黄酮的提取率均有影响，各个因素的影响强弱次序为：乙醇浓度＞液固比＞提取时间＞提取温度。综合考虑，确定最佳组合为：乙醇浓度75%（体积分数），液固比35∶1（mL/g），提取温度65℃，提取时间2 h。在此条件下，樱桃核中类黄酮提取率可达0.803%。此结果与张静敏等［6］的提取结果0.856%相近。

［1］CHUI KL，CHENG YC，CHEN JH，et al.Supercritical fluids extraction of Ginkgo ginkgolides and flavonoids［J］.J Supercrit Fluid，2002，24（15）:77-87

［2］GAO M，SONG BZ，LIU CZ.Dynamic microwave-assisted extraction of flavonoids fromsaussurea medusa maxim cultured cells［J］.Biochen Eng J，2006，32（2）:79-83

［3］LONDONO-LONDON J，LIMA VR，LARA Q，et al.Clean recovery ofantioxiddant flavonoids from citrus peel:Optimizing an aqueous ultra-sound-assisted extraction method［J］.Food Chem，2010，119（59）: 81-87

［4］CALABRN ML，GALTIERI V，CUTRONEO P，et al.Study of the extraction procedure by experimental design and validation of a LC method for determination of flaonoids in Citrus bergamia juice［J］.J Pharmaceut Biomed，2004，35（5）:34-36.

［5］中国医学科学院卫生研究所.食物成分表［M］.北京:人民卫生出版社，1989

［6］张静敏，吕玲玲，郭磊.樱桃核中类黄酮的提取及其抗氧化性研究［J］.中国酿造，2010，219（6）:65-68

Study on the Technology of Flavonoids Extraction from Cherry Seed

SUN Hai-yan1，2
（1.Shaanxi Key Laboratory of Resource Biology，Hanzhong 723000，Shaanxi，China；2.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，Shaanxi，China）

Study on the extraction about the function elements of cherry seed-flavonoids and research into the best process conditions.With the yield of flavonoids for complete index，investigation ethanol co-ncentration，the liquid-solid ratio，extraction temperature and time of extracting flavonoids were studied.The optimial extraction conditional were investigated by single factor experiment and orthogonal test.The results showed that flavonoids best extraction conditions for：alcohol concentration 75%（Volume fraction），the liquid-solid ratio 35∶1 mL/g，extraction temperature of 65℃and extraction time 2 h.Under these extraction conditions，the extractive amount offlavonoids can be as high as 0.803%.

cherry seed；flavonoids；extraction technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.018

2014-11-27

汉中市科技发展专项计划项目（2013hzzx-65）；陕西理工学院校级项目（4280730）

孙海燕（1979—），女（汉），讲师，硕士，主要从事食品保鲜与资源开发方面的教学与研究。