正交试验优选马鞭草中总三萜酸的提取工艺

陈改敏，龚如东，张迪

（南阳医学高等专科学校，河南南阳473061）

正交试验优选马鞭草中总三萜酸的提取工艺

陈改敏，龚如东，张迪

（南阳医学高等专科学校，河南南阳473061）

优选马鞭草中总三萜酸的提取工艺。采用紫外分光光度法测定总三萜酸含量；以总三萜酸得率为指标，采用单因素试验考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数的影响，在此基础上设计正交试验优选马鞭草中总三萜酸的提取工艺。最佳提取工艺为80%乙醇35倍量超声提取3次，每次30 min。在此条件下，总三萜酸得率21.91 mg/g。该工艺稳定可行，为马鞭草中三萜酸的开发利用提供参考。

马鞭草；总三萜酸；正交试验

马鞭草作为传统中药，药用部分为其全草或带根全草，具有活血散瘀、解毒、利水、退黄、截疟等功效，用于治疗痛经经闭、水肿、黄疸、疟疾等病症［1］。马鞭草主要成分有黄酮类、苯丙素类、环烯醚萜类、三萜类、甾体类、糖苷类、挥发性成分和有机酸类等［2-4］。近年来，科研工作者对三萜酸的药理作用研究较多，三萜酸的药理作用主要为抗炎、镇咳、降血脂、降血糖、抗肿瘤［5-7］，生物活性广泛。目前，马鞭草中总三萜酸提取工艺鲜见报道，本试验参照文献［8-10］，采用超声波提取、紫外可见分光光度法进行总三萜酸的含量测定，通过单因素试验和正交试验优化提取工艺，为马鞭草中三萜酸的开发利用奠定基础。

1材料

TU-1901型双光束紫外分光光度计、普析GWAUN2-C-20型超纯水机：北京普析通用仪器有限责任公司；METTLER-XS105DO万分之一分析天平：梅特勒-托利多公司；FW-200A型万能粉碎机：北京科伟有限责任公司；KQ-50E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；齐墩果酸对照品：购自上海晶纯生化科技股份有限公司，批号110087；甲醇、乙醇、石油醚均为分析纯。

马鞭草购于河南省药材公司，经南阳医专药学系姚学文鉴定为Verbena Officinalis L.全草；除杂后，经FW-200A型万能粉碎机粉碎过60目筛网，称取适量样品置于索氏提取器中，加入3倍体积的石油醚于80℃脱色，40℃烘干备用。

2方法与结果

2.1供试品溶液的制备

称取石油醚脱色后粉末2.00 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入80%的乙醇30 mL，超声提取2次，每次30 min，过滤，合并滤液减压浓缩，加入甲醇溶解转移至100 mL容量瓶中，定容摇匀，即得。

2.2对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品适量，用甲醇定容于100 mL容量瓶中，配制成浓度为0.120 0 g/L的对照品溶液，待用。

2.3显色方法及检测波长的确定

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液0.2，0.4 mL于10 mL具塞试管中，水浴将溶剂蒸干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入0.8 mL的高氯酸，充分摇匀，在70℃的水浴中加热15 min，冰水冷却，再加入5 mL的冰醋酸，放置20 min后，用紫外可见分光光度计在400 nm～800 nm范围内进行扫描其吸光度。结果表明，供试品和对照品溶液均在540 nm处有最大吸收峰，因此选540 nm作为测定波长。

2.4标准曲线的绘制

分别精密吸取齐墩果酸对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞试管中，按2.3项下方法显色，以试剂空白为对照，用1 cm×1 cm的比色皿在540 nm处测定吸光度（A）。以齐墩果酸的浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。线性回归方程为：y=8.034 02 x+0.032 06，r=0.999 5。

2.5单因素试验

2.5.1乙醇浓度对总三萜酸得率的影响

准确称取6份经石油醚脱色后马鞭草粉末2.00 g，以料液比1∶35（g/mL），提取时间30 min，提取次数2次，设计乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%，考察乙醇浓度对总三萜酸得率的影响，结果如图1所示。

图1　乙醇浓度对总三萜酸得率的影响Fig.1Effect of volume fraction of ethanol on extraction rate of total triterpenoids

乙醇浓度在80%时，得率达到最大值，之后随浓度增加得率反而逐渐减小。所以乙醇浓度为80%时的提取效果好。故选择乙醇浓度70%、80%、90%3个水平进行优化。

2.5.2料液比对总三萜酸得率的影响

准确称取6份经石油醚脱色后马鞭草粉末2.00 g，以乙醇浓度80%，提取时间30 min，提取次数2次，设计料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50（g/mL），考察料液比对三萜酸得率的影响，结果如图2所示。

图2　料液比对总三萜酸得率的影响Fig.2Effect of the ratio of water to materials on extraction rate of total triterpenoids

得率随着料液比的增加而逐渐增加且趋于平缓。由于提取液体积的增大会增加蒸发浓缩的工作量，为降低分离纯化的成本，因此选择料液比1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）3个水平进行优化。

2.5.3提取时间对总三萜酸得率的影响

准确称取5份经石油醚脱色后马鞭草粉末2.00 g，以料液比1∶40（g/mL），乙醇浓度80%，提取次数2次，设置20、30、40、50、60 min不同的提取时间，研究提取时间对得率的影响，结果如图3所示。

图3　提取时间对总三萜酸得率的影响Fig.3Effect of extracting time on extraction rate of total triterpenoids

在40 min时，总三萜酸得率最大，在此之后得率随时间的延长而逐步下降。故选择提取时间30、40、50 min 3个水平进行优化。

2.5.4提取次数对总三萜酸得率的影响

准确称取5份经石油醚脱色后马鞭草粉末2.00 g，以料液比1∶40g/mL，乙醇浓度80%，提取时间40min，提取不同次数，提取次数与得率的关系如图4所示。

图4　提取次数对总三萜酸得率的影响Fig.4Effect of extraction times on extraction rate of total triterpenoids

随着提取次数的增加，得率逐渐增大且趋于平缓，但溶剂的消耗量增大，考虑到效益诸多方面的因素，故选择提取次数为1、2、3次3个水平进行优化。

2.6正交试验

在单因素试验的基础上，我们选取乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数4个因素为优化条件，用正交表L9（34）设计正交试验。因素水平见表1，试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1　正交试验因素及水平表Table 1Factors and levels of orthogonal experiments

表2　正交试验结果Table 2Result of orthogonal experiments

由表2、表3可知，各因素对马鞭草中总三萜得率的影响大小次序为：提取次数＞料液比＞乙醇浓度＞提取时间。以极差最小的提取时间为误差项进行方差分析，结果显示提取次数对马鞭草总三萜酸得率有显著影响，因而确定最佳的提取工艺条件为A2B2C1D3，即乙醇浓度80%，料液比1∶35（g/mL），提取时间30min，提取次数3次。

表3　方差分析结果Table 3Results of variance analysis

2.7验证试验

按照选定的条件A2B2C1D3重复试验3次，得率分别为21.89、21.90、21.95 mg/g，平均值为21.91 mg/g，说明上述提取工艺是合理的。

3小结

本文在单因素试验的基础上进行了正交试验，确定了超声波法提取马鞭草中总三萜酸的最佳工艺；本试验采用紫外分光光度法进行测定，操作方便，测定结果准确、快速，简单易行。本文首次研究了马鞭草中总三萜酸的含量测定及提取工艺，为马鞭草中三萜酸的开发利用奠定基础。

［1］中国药典委员会.中国药典:一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:49

［2］任非，段坤峰，付颖，等.马鞭草镇咳有效部位化学成分的研究［J］.中国医院药学杂志，2013，33（6）:445-449

［3］陈兴丽，孟岩，张兰桐，等.马鞭草化学成分和药理作用的研究进展［J］.河北医药，2010，32（15）:2089-2091

［4］田菁，赵毅民，栾新慧.马鞭草化学成分的研究［J］.中国中药杂志，2005，30（4）:268-269

［5］鞠建华，周亮，林耕，等.枇杷叶中三萜酸类成分及其抗炎、镇咳活性研究［J］.中国药学杂志，2003，38（10）:752-757

［6］马路，史大卓，陈可冀，等.山楂总三萜酸对大鼠肝细胞合成14C-胆固醇及肝细胞膜HDL受体活性的影响［J］.中国医院药学杂志，2009，29（21）:1807-1810

［7］李锋，王航，薛原楷，等.枇杷叶三萜酸降血糖活性实验研究［J］.药物生物技术，2011，18（4）:328-331

［8］尤努斯江·吐拉洪，木妮热·依布拉音，吐尔洪·买买提.阿里红中总三萜酸的提取工艺优选及含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（17）:24-27

［9］张慧，尹永芹，汤文伟，等.鸭脚木皮中总三萜的提取工艺优化［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（8）:5-7

［10］赖红芳，邓秋芬.半仿生法提取鸡骨草中总三萜酸的工艺优选［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（24）:46-48

Optimization of Extraction Technology of Total Triterpenoids from Verbena officinalis L.by Orthogonal Test

CHEN Gai-min，GONG Ru-dong，ZHANG Di
（Nanyang Medical College，Nanyang 473061，Henan，China）

To optimize the extraction technology of total triterpenoids from Verbena officinalis L..The content of total triterpenoids was determined by UV with oleanic as reference；Effects of concentration of extraction solvent，solid-liquid ratio，extraction time and extraction times by taking yield of total triterpenoids as the index，basis on this，extraction technology was optimized by orthogonal test.The optimum extraction technology were as follow：extracted 3 times with 35 times the amount of 80%ethanol，30 min each time.Under these conditions，yield of total triterpenoids from Verbena officinalis L.was 21.91 mg/g.This extraction process was stable and feasible，which provide the reference for the development and utilization of triterpenoids from Verbena officinalis.

Verbena officinalis L.；total triterpenoids；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.017

2015-05-04

南阳市科技局项目（2013GG056）

陈改敏（1980—），女（汉），讲师，主要从事天然药物化学和药物分析的研究。